南京卡米洛生物工程有限公司，屬于科研用ELISA試劑盒的生產(chǎn)、研發(fā)企業(yè)。專注于ELISA試劑盒的研發(fā)十多年，研發(fā)與生產(chǎn)能力值得信奈。
市面上現(xiàn)有的ELISA試劑盒有時可能滿足不了老師的實驗要求，因為我們可以根據(jù)老師的需求，靈活的進行研發(fā)，定制，生產(chǎn)。
以下是我們的試劑盒示例說明書，供您參考
本試劑盒采用雙抗體夾心法，雙抗體夾心原理，是基于要測試的抗原具有二價以上的特性，能識別包被抗體，同時能識別檢測抗體，具體過程如下：
- 將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)，并用無關蛋白封閉空余結(jié)合位點。
- 加受檢標本使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
- 加生物素標記抗體，使固相免疫復合物上的抗原與生物素標記抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的生物素標記抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關。
- 加辣根過氧化物酶標記親和素，使生物素標記抗體與辣根過氧化物酶標記的親和素結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標記物。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關。
- 加入底物顯色，即可計算標本濃度。
- 注：一個抗體分子上可以標記上若干個生物素分子，一個生物素分子可以結(jié)合一個辣根過氧化物酶標記的親和素，從而帶來了大量的辣根過氧化物酶結(jié)合到抗體上，比傳統(tǒng)的直接辣根過氧化物酶標記抗體具有更高的敏感性和放大效應。
【人Asprosin酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理】
本實驗采用雙抗體夾心ELISA法。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為抗人Asprosin單克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體，經(jīng)生物素（biotin）標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。
【人Asprosin酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理示意圖】
【試劑盒組成】
名稱 96 Tests 48 Tests 保存條件
1．人Asprosin抗體包被板條 8×12 8×6 4/-20℃
2．人Asprosin標準品 2 支（凍干） 1 支（凍干） 4/-20℃
3．濃縮生物素化人Asprosin抗體 1支 1 支 4/-20℃
4．濃縮酶結(jié)合物(ABC) 1支 1 支 4/-20℃
5. 酶結(jié)合物(ABC)稀釋液 1瓶 1瓶 4/-20℃
6．抗體稀釋液 1瓶 1 瓶 4/-20℃
7．標準品稀釋液 1瓶 1 瓶 4/-20℃
8．樣品稀釋液 1瓶 1 瓶 4/-20℃
9．濃縮洗滌液 1 瓶（25×） 1 瓶（25×） 4/-20℃
10．顯色劑A 1 瓶 1 瓶 (避光) 4/-20℃
11．顯色劑B 1 瓶 1 瓶 4/-20℃
12．終止液 1 瓶 1 瓶 4/-20℃
13．說明書 1 份 1 份 室溫
【試驗所需自備試驗設備和器材】
- 酶標儀(450nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片) 。
- 洗板機（可調(diào)注液量，保證每孔350μl洗液而不溢出）。
- 超凈工作臺，生物安全柜，通風柜。
- 高精度單道加液器（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl).
- 高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl).
- 37℃恒溫箱。
- 低溫離心機。
- 電冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.
- 分析天平。
- 剪刀，鑷子，鉗子等。
- 漩渦混合儀，低頻振蕩器等。
【試驗所需自備試驗耗材及試劑】
- 離心管（容量為1.5ml，5ml等）。
- 一次性吸頭（量程為0.5-10μl, 2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.
- 純凈水或蒸餾水。
- 坐標紙。
- 吸水紙。
- EDTA，枸櫞酸鈉，肝素
【標本收集注意事項】
- 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
- 血清和血漿避免使用溶血，高血脂標本。
- 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
- 標本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃電冰箱內(nèi)，避免反復凍融。
- 可根據(jù)標本的實際情況，做適當倍數(shù)稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數(shù)) 。
- 收集標本，盡量做到雙份的用量，避免一次實驗失敗，重復實驗時標本缺失，從而耽誤實驗進程。
- 收集標本時，應該做好防護措施（比如戴手套，護目鏡等），認為所有標本都具有一定的潛在危險性。
- 樣本處理應該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。
【標本處理辦法】
- 血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。
- 血漿：用EDTA，枸櫞酸鈉，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm離
心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）
保存。
- 組織勻漿：切取組織塊，0.01MPBS中過洗一次；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。
- 細胞培養(yǎng)上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。
- 尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃3-6個月）保存。
注：樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱相關文獻了解標本內(nèi)待測因子的含量，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的佳檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。
【注意事項】
- 試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復溶后的標準品，其他成分不可凍結(jié)。
- 濃縮生物素化人Asprosin抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。
- 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液。
- 測試過程中，人Asprosin凍干標準品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時候后，會迅速失活。
- 操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
- 配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y試結(jié)果尤為重要，好使用微量振蕩器(使用低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應液混勻。
- 實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規(guī)范操作，并在使用前充分預熱。
- 酶免試驗中人Asprosin標準品和樣本檢測時建議作復孔。
- 將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2-8℃保存。
- 顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
- 超過使用有效日期的試劑盒不能應用于實驗中。
- 試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，波長應該設置為450nm和630nm.
- 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時必須注意安全。
- 各步驟加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校準其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，使用排槍加樣。
- 每次試驗測定的同時做標準曲線，好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔高濃度的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。
- 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
- 以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于350μl, 注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時, 用帶紙屑的吸水材料應慎重, 防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應。
- 用終止液終止反應后，請于10分鐘內(nèi)讀取OD值。
- 進行復孔實驗時，結(jié)果計算一定要求平均值。
- 標本溶血可能會有假陽性結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
- 試驗時，應該將加過樣品的板條放于密閉盒內(nèi)，并保持濕度約60%左右。
- 為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準。以確保實驗溫度保持恒定。
- 48T的試劑盒，所有組分均為96T的50%的量。
- 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
【檢測前準備工作】
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進行試驗。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回 。
3. 人Asprosin標準品: 加入標準品稀釋液1.0ml至凍干人Asprosin標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為10 ng/ml)，之后在管身標注①，然后根據(jù)需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度：10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 ng/ml)。 注意：務必要保證凍干標準品*溶解和混勻。
4. 標準品稀釋方法圖例： 取7支潔凈的試劑管，分別標注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧. 每管加入300μl標準品稀釋液。從第①管內(nèi)取出300μl加入到第②管，混勻后，再從第②管取出300μl加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標準品稀釋液，作為陰性對照使用。
注：復溶標準品原液（10 ng/ml）請廢棄，不可重復使用。
5.生物素化人Asprosin抗體工作液：按當次試驗所需用量，用抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)，配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。
6.酶結(jié)合物工作液：按當次試驗所需要用量，用酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1:100)，配置成酶結(jié)合物工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。
7.TMB顯色工作液：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份（9：1）的比例配制TMB顯色工作液。
【洗滌方法】
1．自動洗板機：要求注入的洗滌液為350μl，注入與吸出間隔20－30秒。確保機器運用熟練后，再投入實驗中使用。
2．手工洗板：每孔加洗滌液350μl，靜置30秒后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。手工洗板時，注意加入洗液的過程中，不要造成孔間污染，從而出現(xiàn)跳孔的現(xiàn)象。
【操作步驟】
- 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)封存于2-8℃。
- 預留空白孔（若使用雙波長讀板，空白孔可以不設）。
- 分別將標本或不同濃度人Asprosin標準品（0ng/ml孔加標準品稀釋液）加入相應孔中(100μl/孔)， 37℃孵箱孵育90分鐘。
- 提前30分鐘制備生物素化人Asprosin抗體工作液。
- 洗板2次。
- 加入生物素化人Asprosin抗體工作液(100μl/孔)。37℃孵箱孵育60分鐘。
- 提前30分鐘制備酶結(jié)合物工作液。室溫避光放置。
- 洗板3次。
- 除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分鐘。
- 洗板5次。
- 加入TMB顯色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，當標準曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時候，即可終止。試驗顯色反應請勿超過30分鐘。
- 加入終止液（包括空白孔）100μl/孔，混勻后即刻測量OD（450nm）值(10分鐘內(nèi))。
【結(jié)果判斷】
1．每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值。（若不減零孔值，標準曲線的零孔應相交于Y軸）
2．手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3進行結(jié)果計算。
3．若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。
注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線來計算標本含量。
【操作程序總結(jié)】
準備試劑，樣品和標準品
加入準備好的樣品和標準品，37℃反應90分鐘
洗板2次，加入生物素化抗體工作液，37℃反應60分鐘
洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應30分鐘
洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應
加入TMB終止液
10分鐘之內(nèi)酶標儀測OD值
計算標本待測因子含量
、試劑盒參數(shù)
【檢測范圍】10ng/ml-0.156ng/ml
【靈敏度】min可測人Asprosin達0.05ng/ml.
【特異性】系統(tǒng)和其它因子無交叉反應。
【批間差】≤12%.
【批內(nèi)差】≤8%.
【回收率】70-110%.
【保存】-20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
【用途】用于體外定量分析液體標本（通用型）。
【規(guī)格】96T.
【生產(chǎn)日期】見酶標板鋁箔袋封口鋼印。
【有效期】12個月（-20℃）.
