產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

綠色熒光FITC標記的鬼筆環(huán)肽會選擇性結(jié)合F-肌動蛋白。鬼筆環(huán)肽衍生物經(jīng)常以納摩爾濃度使用，常在甲醛固定和透化的組織切片、細胞培養(yǎng)或無細胞實驗中用于標記、鑒定和定量F-肌動蛋白的便捷探針。鬼筆環(huán)肽與肌動蛋白絲的結(jié)合比與肌動蛋白單體的結(jié)合要緊密得多，從而導致肌動蛋白亞基從絲端解離的速率常數(shù)降低，從而通過防止絲解聚而基本穩(wěn)定了肌動蛋白絲。而且，發(fā)現(xiàn)鬼筆環(huán)肽抑制F-肌動蛋白的ATP水解活性。鬼筆環(huán)肽在細胞中不同濃度下的功能不同。當以低濃度引入細胞質(zhì)時，鬼筆環(huán)肽將聚合度較低的胞質(zhì)肌動蛋白和纖維蛋白吸收到聚集的肌動蛋白聚合物的穩(wěn)定“島”中，但它不會干擾應力纖維，即厚的微絲束。鬼筆環(huán)肽的性質(zhì)是研究F-肌動蛋白在細胞中分布的有效工具，方法是用熒光類似物標記鬼筆環(huán)肽并將其用于染色肌動蛋白絲以進行光學顯微鏡觀察。鬼筆環(huán)肽的熒光衍生物已被證明在定位活細胞或固定細胞中的肌動蛋白絲以及體外觀察單個肌動蛋白絲方面非常有用。熒光鬼筆環(huán)肽衍生物已被用作高分辨率研究肌動蛋白網(wǎng)絡的重要工具。

產(chǎn)品性質(zhì)

1.分子式（Molecular Formula）：C56H60N10O15S2

2.分子量（Molecular Weight）：1177.3

3.最大激發(fā)/發(fā)射波長（Ex/Em）:495~496/513~516nm

4.多肽序列（Sequence）:FITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3   to 6)

5.外觀（Appearance）:黃色粉末（凍干粉）

6.溶解性（Solubility）:溶于DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液（20%）

本品以1000×儲存液形式（溶于DMSO）提供，按照100µl/孔（96孔板），總共可做300T。

warbio 生物也提供粉末形式，濃度自行配置使用, 可直接溶于甲醇或DMSO配置成適當濃度的儲存液。之后用PBS或PBS+1% BSA稀釋到合適的工作濃度。常用工作濃度范圍80-200nM。

注意事項：    

鬼筆環(huán)肽的分子量小，很容易通過細胞，不需要對細胞進行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

自備實驗材料

1.1 FITC Phalloidin（貨號LX4520）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號 SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號 J8660）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

操作步驟

1. 工作液準備

1）對于FITC標記鬼筆環(huán)肽（貨號：LX4520）

本品以溶于甲醇的20µM儲存液形式提供，總量為300µl。按照100 nM的工作液濃度來換算，可制備總量為60 ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）對于FITC標記鬼筆環(huán)肽（貨號：LX2226）

Warbio生物凍干粉形式提供，分子量為1177.3，總量為1mg。可先用甲醇或者DMSO充分溶解配制成20~100µM的儲存液。如，加入8.494ml甲醇到1mg鬼筆環(huán)肽即得到100µM等量的儲存液，根據(jù)單次使用量，進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 染色步驟

1）細胞爬片生長24h，使其密度達到50%匯合度。

2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細胞2次。

3）使用溶于PBS的4%溶液進行細胞固定，室溫固定10min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。

4）室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10min。

5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

6）室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10min。

7）取200µl配制好的 FITC標記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：為了降低背景，可于FITC標記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。

8）用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

9）使用200µl DAPI溶液（濃度：100 nM）對細胞核進行復染，約30s。

10）用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油封片。此法制備的標本玻片可置于4℃避光保存，通常6個月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑（合并步驟9）10），簡化步驟。

11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=496/516nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

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