Amplite 基質(zhì)金屬蛋白酶MMP活性檢測(cè)試劑盒 紅色熒光 是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)MMP的試劑盒，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）構(gòu)成鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，其在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)起作用。 這些酶負(fù)責(zé)結(jié)締組織的分解，并且在骨重塑，月經(jīng)周期和組織損傷的修復(fù)中是重要的。雖然很難評(píng)估MMP對(duì)某些病理過(guò)程的確切貢獻(xiàn)，但MMP似乎在關(guān)節(jié)炎的發(fā)展以及癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。
我們的Amplite 通用熒光MMP活性測(cè)定試劑盒使用Tide Fluor 2（TF2）/ Tide Quencher 2（TQ2）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）肽作為通用MMP活性指示劑。 它旨在檢查MMP酶的一般活性并篩選MMP抑制劑。 在完整的FRET肽中，TF2的熒光被TQ2猝滅。 在通過(guò)MMP切割成兩個(gè)單獨(dú)的片段后，回收TF2的熒光。 TF2探針具有優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率和更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，比EDANS / Dabcyl FRET底物靈敏得多。 其信號(hào)可通過(guò)熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 490/525 nm處輕松讀取。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供的Amplite 基質(zhì)金屬蛋白酶MMP活性檢測(cè)試劑盒。
96孔板測(cè)定示例
概述
添加適當(dāng)?shù)膶?duì)照或測(cè)試樣品（50μL）
預(yù)孵育10-15分鐘
添加MMP Green 底物溶液（50μL）
孵育0分鐘（用于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)）或30分鐘至1小時(shí)（終點(diǎn)讀數(shù)）
在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度
注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。
操作方法
1.根據(jù)需要制備含有生物樣品的MMP。
2.pro-MMPs：
2.1制備2mM APMA工作溶液（2X）：用1：500稀釋1M APMA（組分B）和測(cè)定緩沖液（組分C），得到2mM APMA工作溶液（2X）。
注意：APMA屬于有機(jī)汞。 小心輕放！ 根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理。
2.2用APMA包埋MMPs：用等體積的2mM APMA工作溶液（2X，來(lái)自步驟2.1）孵育含有MMP的樣品或純化的MMPs。 有關(guān)孵育時(shí)間，請(qǐng)參閱說(shuō)明書(shū)中的附錄I. 在實(shí)驗(yàn)之前立即MMP。
注意1：將含酶樣品保存在冰上。 避免劇烈渦旋酶。長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存活化酶會(huì)使酶失活。
注意2：對(duì)于酶活化，優(yōu)選在較高蛋白質(zhì)濃度下活化。后，您可以進(jìn)一步稀釋酶。
3.準(zhǔn)備工作解決方案：
3.1制備MMP Green 底物工作溶液：用1：100稀釋MMP Green 底物（組分A）和測(cè)定緩沖液（組分C），如說(shuō)明書(shū)中表1所示。
3.2制備MMP稀釋：如果使用純化的MMP，則在測(cè)定緩沖液（組分C）中將MMP稀釋至合適的濃度。
注意：Pro-MMP需要在使用前（參見(jiàn)步驟2.2）。 避免劇烈渦旋酶。
3.3制備抑制劑和化合物稀釋：如果您正在篩選MMPs抑制劑，請(qǐng)根據(jù)需要稀釋已知的MMPs抑制劑和測(cè)試化合物。
4.根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的表2和表3在96孔微孔板中建立酶促反應(yīng)：
5.運(yùn)行酶反應(yīng)：
5.1如果您正在篩選MMPs抑制劑，則將培養(yǎng)板在酶反應(yīng)（例如25°C或37°C）的所需溫度下預(yù)孵育10-15分鐘。
5.2將50μL（96孔）或20μL（384孔）MMP Green 底物溶液（來(lái)自步驟3.1）加入到測(cè)定板的樣品和對(duì)照孔中。充分混合試劑。
5.3用Ex / Em = 490 / 525nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。
動(dòng)態(tài)讀數(shù)：立即開(kāi)始測(cè)量熒光強(qiáng)度，每5分鐘連續(xù)記錄數(shù)據(jù)30至60分鐘。
終點(diǎn)讀數(shù)：在室溫下孵育反應(yīng)30至60分鐘，如果可能，避免光照。 充分混合試劑，然后測(cè)量熒光強(qiáng)度。
