相關(guān)產(chǎn)品
NEBNext 酶學轉(zhuǎn)化法甲基化建庫相關(guān)產(chǎn)品
NEBNext 酶學轉(zhuǎn)化法甲基化建庫試劑盒
NEBNext 甲基化建庫酶學轉(zhuǎn)化法模塊
NEBNext Q5U™ 預混液
NEBNext 酶學轉(zhuǎn)化法甲基化建庫多樣本接頭引物（雙端檢索引物）
概述
雖然重亞硫酸鹽測序是研究 DNA 甲基化的金標準，但這種轉(zhuǎn)化方式會對DNA 造成損傷，導致 DNA 斷裂、丟失和 GC 偏嗜。NEBNext 酶學轉(zhuǎn)化法甲基化建庫試劑盒 (EM-seq™) 提供了一種酶學方法代替全基因組重亞硫酸鹽處理 DNA (WGBS) 的方法，并結(jié)合高效流程化的建庫步驟，適用于 Illumina 平臺測序。高效的 EM-Seq 酶促轉(zhuǎn)化可ZUIDA程度地減少對DNA的損傷，結(jié)合提供的 NEBNext Ultra II 文庫制備流程，最終產(chǎn)生的高質(zhì)量文庫可以從有限的測序數(shù)據(jù)中更靈敏的檢測到 5-mC 和 5-hmC。
優(yōu)勢
的 5-mC 和 5-hmC 檢測靈敏度
更高的比對率
更均一的 GC 覆蓋度
能從有限的測序數(shù)據(jù)檢測到更多的 CpG 位點
更均一的二核苷酸分布
更長的文庫插入片段
更高效的建庫流程
提供轉(zhuǎn)化模塊
產(chǎn)品特點
EM-Seq 能得到更高的文庫產(chǎn)量。采用Covaris S2 儀器將 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因組 DNA 打斷至 300 bp，同時作為 EM-Seq 和 WGBS 建庫的起始樣本。對于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 進行建庫，隨后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。上述所有起始量，EM-Seq 都能使用更少的 PCR 循環(huán)得到更高的文庫產(chǎn)量，表明 EM-Seq 顯著減少了 WGBS 方法中的 DNA 損失。誤差條表示標準差。
NEBNext 酶學轉(zhuǎn)化法甲基化文庫可獲得更長的插入片段 。采用Covaris® S2 儀器將 50 ng 人 NA12878 基因組 DNA 打斷至 300 bp，同時作為 EM-Seq 和 WGBS 建庫的起始樣本。對于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 進行建庫，隨后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 試劑盒進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。兩個文庫均使用 Illumina MiSeq (2 X 76 bases) 測序，片段大小采用 Picard 2.18.14 測定。圖中繪制了每個插入片段出現(xiàn)的頻率標準化后的數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖：EM-Seq 建庫后的插入片段比 WGBS 方法得到的插入片段更長，說明：酶學轉(zhuǎn)化法不會對 DNA 造成損傷，而重亞硫酸鹽處理的 DNA 有嚴重損傷。
相較于 WGBS，EM-Seq 在更低的測序深度情況下能檢測到更多的 CpG 位點，并能實現(xiàn)更的 GC 均一覆蓋度。采用Covaris S2 儀器將 10 ng, 50 ng, 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因組 DNA 打斷至 300 bp，同時作為 EM-Seq 和 WGBS 建庫的起始樣本。對于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 進行建庫，隨后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 試劑盒進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。兩個文庫均使用 Illumina NovaSeq® 6000 (2 X 100 bases) 測序，使用 bwa-meth 0.2.2 將 測序數(shù)據(jù) 與 hg38 進行比對。
A: CpG 位點檢測：通過分析 3.24 億雙端數(shù)據(jù)得到 EM-Seq 和 WGBS 文庫的 CpG 位點覆蓋度，其中每條鏈都獨立計數(shù)，最終得到最多 5600 萬個可能的 CpG 位點。結(jié)果顯示：EM-Seq 在更低測序深度能檢測到更多的 CpG 位點。
B: GC 覆蓋度：使用 Picard 2.17.2 計算 GC 覆蓋度，圖中顯示不同 GC 含量時 (0-100%)，標準化后覆蓋度的分布情況。結(jié)果顯示：EM-Seq 文庫顯著提高 GC 覆蓋度的均一性，無 AT 過度測序，也無 GC 測序不足，后兩項都是 WGBS 文庫的典型缺陷。
相較于 WGBS，EM-Seq 在更低的測序深度情況下能檢測到更多的 CpG 位點。采用 Covaris S2 儀器將 10 ng、50 ng 和 200 ng 不同起始量的人 NA12878 基因組 DNA 打斷至 300 bp，同時作為 EM-Seq 和 WGBS 建庫的起始樣本。對于 WGBS 方法，使用 NEBNext Ultra II DNA 進行建庫，隨后采用 Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ 試劑盒進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。兩個文庫均使用 Illumina NovaSeq® 6000（2 X 100 bases）測序，使用 bwa-meth 0.2.2 將測序數(shù)據(jù)與 hg38 進行比對。通過分析 3.24 億雙端數(shù)據(jù)得到 EM-Seq 和 WGBS 文庫的 CpG 位點覆蓋度。
圖中顯示了 EM-Seq 和 WGBS 兩種方法在不同起始量，至少 1X 和 8X 測序深度下檢測到的DUYOU和共有的 CpG 位點。EM-Seq 在至少 1X 測序深度下比 WGBS 多檢測到 20% 以上的 CpG 位點。而在至少 8X 測序深度下，CpG 位點覆蓋度差異增加至 2 倍。
