B1（AF B1）ELISA試劑盒

本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷

                      B1快速檢測試劑盒

使用說明書

【產(chǎn)品簡介】

是一類真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很強的致癌性，主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些和人類血液，動物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。其中B1的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。薄層色譜一直是檢測常用的方法，但是此方法制備樣品及分析樣品時費時又費力。而使用B1 ELISA試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中B1殘留。參考國家標準GB/T 5009.22-2003。

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物B1和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭B1抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物B1的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較可得出相應(yīng)殘留物B1的含量。

【試劑盒技術(shù)指標】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.025ppb

檢測時間： 75min

樣本檢測下限：

大米、玉米、小米………………………………2.5ppb

醬油、醋…………………………………………0.5ppb

食用油……………………………………………2.5ppb

酒類（葡萄酒、啤酒、黃酒）…………………0.5ppb

花    生……………………………………………2.5ppb

月餅、桃酥、花生醬等……………………………1ppb

面    粉………………………………………………1ppb

一般飼料…………………………………………2.5ppb

飼料（配合料及濃縮料）…………………………1ppb

牛奶………………………………………………0.5ppb

反應(yīng)率：

B1……………………………………99%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

飼    料…………………………………………75±10%

【試劑盒組成】   

1、 微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb

3、 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶） 10ppb

4、 酶標記物       12ml…………………………紅色帽

5、 抗體工作液     7ml…………………………綠色帽

6、 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

7、 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

8、 終 止 液          7ml…………………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40ml……………………白色帽

10、 2X濃縮復(fù)溶液  50 ml…………………… 藍色帽

【所用儀器、試劑】   

儀          器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/

                     氮氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、

                     刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：甲醇、三氯甲烷、正己烷、濾紙

【實驗前溶液配制】

配液1、50%甲醇溶液：

 50ml蒸餾水或去離子水和50ml純甲醇混合制備50％甲醇溶液。

配液2、將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣品的稀釋。

配液3、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時，都必須注意：

（1）實驗中須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭

（2）實驗之前須檢查實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

一、食品

（a）脂肪含量小的固體樣品(如大米、玉米、小米等)

1、稱取1g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min。

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取出上清液50ul與稀釋后的復(fù)溶液450ul 充分混合30s

      取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數(shù):100

(b)醬油、醋

1、稱取2g樣品于50ml離心管中；先加入3ml去離子水充分混勻，再加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；

2、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

4、取50ul與稀釋后的復(fù)溶液950ul 充分混合30s，

      取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數(shù):20

(c)食用油(如菜油、麻油、色拉油、花生油等)

1、稱取1g油樣品于10ml離心管中，先加入2ml 正己烷，再加入5ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取下層溶液50ul與稀釋后的復(fù)溶液200ul 充分混合30s

      取50ul進行分析。

     樣本稀釋倍數(shù):25

(d)酒類（葡萄酒、啤酒、黃酒）

1、稱取2g酒樣品于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；

2、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

4、取50ul與稀釋后的復(fù)溶液950ul 充分混合30s，

      取50ul進行分析。

      樣本稀釋倍數(shù):20

(b)花生

1、稱取1g粉碎的樣品于50ml離心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取下層溶液50ul與稀釋后的復(fù)溶液450ul 充分混合30s

      取50ul進行分析。

     樣本稀釋倍數(shù):100

(e)月餅、桃酥、花生醬等

1、稱取2g粉碎的樣品于50ml離心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取下層5mL提取液于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。

3、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

4、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

5、取50ul與稀釋后的復(fù)溶液950ul 充分混合30s，

      取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數(shù):40倍

(f)面粉

1、稱取2g面粉樣品于50ml離心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取過濾溶液5mL于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。

4、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

6、取50ul與稀釋后的復(fù)溶液950ul 充分混合30s，

      取50ul進行分析。

       樣本稀釋倍數(shù):40倍

二、飼料

(a)一般飼料及原料（脂肪和蛋白含量小的飼料)

1、稱取1g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5分鐘。

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取出上清液50ul與稀釋后的復(fù)溶液450ul 充分混合30s

      取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數(shù):100

(b)配合料及濃縮料（脂肪和蛋白含量高的飼料)

1、稱取2g樣品于50ml離心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取過濾溶液5mL于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。

4、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

6、取50ul與稀釋后的復(fù)溶液950ul 充分混合30s，

      取50ul進行分析。

      樣本稀釋倍數(shù):40倍

三、乳制品

(a)生鮮牛奶；

     1、直接取50µl牛奶+950µl稀釋后的復(fù)溶液混合30s；

     2、取50µl用于檢測檢測分析。

          樣本稀釋倍數(shù):20

(b)奶粉、奶油、奶酪

1、稱取5g樣品于50ml離心管中，加入10ml甲醇，強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

3、用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，

4、取50ul下層溶液進行檢測分析。

     樣本稀釋倍數(shù):1

【備注】

       如根據(jù)樣品的國家允許量標準判定（詳見附件表），在樣品測定前，用稀釋后的復(fù)溶液將樣品提取液再進一步進行適當倍數(shù)稀釋，即為待測樣品液； 取50ul待測樣品液進行定量或限量測定。

【酶標免疫分析程序】

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、  顯色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）測定吸光度值（OD值）。

B1（AF B1）ELISA試劑盒

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與B1的含量成負相關(guān)

1、粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含M1濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.248，樣品2的吸光度值為1.021，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.821；0.025ppb為1.434；0.075ppb為1.163； 0.225ppb為0.767； 0.675ppb為0.298； 2.025ppb為0.106。則樣品1的濃度范圍0.675ppb-2.025ppb；樣品2的濃度范圍0.075ppb-0.0.225ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中B1的實際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以99%，即百分吸光度值。