英國Oxford 新一代超分辨熒光顯微鏡Nanoimager
英國Oxford Nanoimaging公司生產(chǎn)的產(chǎn)品超分辨熒光顯微鏡-Nanoimager 是由牛津大學(xué)Achillefs Kapanidis教授團(tuán)隊經(jīng)過8年時間研發(fā)而成的，是一種新型的單分子顯微鏡，也是世界上一款無需校準(zhǔn)、無需光學(xué)平臺、超小型臺式超分辨顯微鏡。Nanoimager突破了傳統(tǒng)光學(xué)的衍射極限，分辨率可達(dá)20nm，是一臺大視野單分子FRET顯微鏡。Nanoimager簡單易用、設(shè)計緊湊，使用安全無害的一級激光，用戶在普通的實驗室桌面上即可獲得高分辨率的單分子熒光圖像 。適用于單分子示蹤、活細(xì)胞成像、蛋白互作、3D成像等研究。
Nanoimager技術(shù)特征
超分辨率成像
♦ 支持同時雙色成像和順序四色成像
♦ 高能量帶來高精度
♦ 三維成像
♦ 隨機光學(xué)重建顯微技術(shù) (dSTORM)和光激活定位顯微技術(shù) (PALM)
√ 無需光學(xué)平臺
√ 使用前無需校準(zhǔn)
√ 操作簡單方便
√ 便攜式，體積小
√ 普通實驗桌即可安置
√ 采用1級激光，使用安全
Nanoimager顯微鏡設(shè)計
♦ Nanoimager具有和傳統(tǒng)顯微鏡不同的特殊設(shè)計。傳統(tǒng)顯微鏡需要集成單分子檢測功能的配件，同時也會帶來配件的限制性，而Nanoimager是專門為單分子超分辨成像而設(shè)計，為了達(dá)到更高的效率而移除了多余的成像元件；
♦ 配置更加安全的一級激光,Nanoimager可在任何辦公室、實驗室和教室使用。相對于放置于暗室的大型顯微鏡,Nanoimager更加方便用戶的使用；
♦ Nanoimager的顯微鏡單位面積小于A4紙；配套的激光器通過光纖連接至顯微鏡；
♦ 與定制的顯微鏡和傳統(tǒng)的顯微鏡設(shè)計不同， Nanoimager始終保持校準(zhǔn)狀態(tài)。樣品準(zhǔn)備好后可以直接成像，無需花費時間進(jìn)行調(diào)試和校正。
♦ Nanoimager的封閉式系統(tǒng)能夠防止偏移發(fā)生并阻止灰塵和其他污染物進(jìn)入，可以一直保持在正常工作狀態(tài)。作為一款臺式機， Nanoimager不需要傳統(tǒng)顯微鏡昂貴的配套設(shè)施，無需額外配置溫控房間、光學(xué)平臺、激光室或暗室。
Nanoimager技術(shù)原理
Nanoimager采用PALM/dSTORM技術(shù)，利用單分子定位算法并結(jié)合光學(xué)系統(tǒng)艾里斑的形狀，以超高精度（納米量級）獲得熒光分子的中心位置，然后用CCD將其信號進(jìn)行采集轉(zhuǎn)化最終得到分辨率為20nm的超分辨圖像。
成像模式
相對于普通的Epifluorescence(EPI)/模式，Nanoimager有total internal reflection fluorescence (TIRF)/ highly inclined and laminated optical sheet (HILO)兩種模式可自由切換。
EPI：激發(fā)較厚的樣品（＞10um），信號噪聲強，即傳統(tǒng)模式。
TRIF：激發(fā)薄層樣品（＜200nm），信號噪聲弱，適用于膜表面成像。
HILO：激發(fā)樣品厚度（＜10um），信號噪聲較弱，適用于大部分成像。
應(yīng)用領(lǐng)域
應(yīng)用案例
1、單分子FRET
Nanoimager是一臺用于大視野單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的商業(yè)化儀器。 FRET是一種兩個熒光分子間非輻射性的能量轉(zhuǎn)移方式，反映兩者的分子間距。 FRET一般在2 – 10 nm的間距發(fā)生。 smFRET研究中，作為供體的熒光分子由激光激發(fā)，將能量轉(zhuǎn)移至臨近的受體熒光分子。被激發(fā)的受體將能量以熒光形式發(fā)散。供體與受體可以連接至同一個或者不同的分子。
smFRET可以用于測量核酸或者單個蛋白分子的分子內(nèi)距離，也可以用于研究蛋白亞基間的相互作用；還可應(yīng)用于研究藥物對于酶結(jié)合位點的構(gòu)象動力學(xué)的作用，或是神經(jīng)退行性疾病中蛋白的聚集。 smFRET可以用于在單分子層面推到結(jié)合常數(shù)、反應(yīng)途徑與停滯時間而不受總體平均值干擾。
Nanoimager適用于smFRET的關(guān)鍵功能包括：同時雙色成像；單分子散射光強度和總體平均的實時分析；視野中數(shù)千個單分子的高通量成像，以及用交替熒光激發(fā) (ALEX) smFRET的功能來定量化學(xué)計量與FRET效率。圖4是smFRET用于研究單個DNA霍利迪交叉的動力學(xué)。
2、單分子示蹤
Nanoimager可以在兩個通道同時示蹤細(xì)胞或者純化物樣品中的單分子 (圖5)，并計算擴(kuò)散系數(shù)。細(xì)胞中分子的擴(kuò)散系數(shù)可以被示蹤，如酶或蛋白可以通過藥物和抗生素的反應(yīng)來示蹤。低擴(kuò)散率可以表示標(biāo)記分子與另一分子或結(jié)構(gòu)的相互作用或相結(jié)合。同時示蹤兩種標(biāo)記了不同熒光分子的分子可以確定兩者動態(tài)相互作用的水平。
Nanoimager可以直接反映純化樣品中熒光粒子的擴(kuò)散率和預(yù)估大小，具有敏感性 (單熒光分子級別) 和特異性 (雙色標(biāo)記可以顯著降低檢測雜質(zhì)的可能性)。
3、使用Nanoimager成像—更大的視野
Nanoimager的每個成像通道均有50 µm x 80 µm的大視野，而其他大部分單分子顯微設(shè)備只有20µm x 20 µm的視野。視野中照明均勻，可以實現(xiàn)單分子或細(xì)胞的高通量成像并快速收集數(shù)據(jù)。
下圖顯示了以10倍于其他技術(shù)的速度對突變的大腸桿菌細(xì)胞的不同表型進(jìn)行成像。為了獲得不同表型的可靠的結(jié)果，需要對大量細(xì)胞進(jìn)行比較。使用具有大視野，能夠自動對焦和自動獲取數(shù)據(jù)的Nanoimager可以顯著加快整個實驗速度和通量。將大視野與超分辨成像結(jié)合是Nanoimager的優(yōu)勢。
