BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表達(dá)載體試劑盒兼具了傳統(tǒng) RNAi 載體的優(yōu)勢(shì)（穩(wěn)定表達(dá)和使用病毒遞送的能力）與組織特異性表達(dá)和同一轉(zhuǎn)錄本中多次靶標(biāo)基因敲低能力。包括在 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表達(dá)載體試劑盒中的 pcDNA™6.2-GW/miR 載體設(shè)計(jì)用于表達(dá)人工 miRNA，其經(jīng)基因工程改造后與靶序列具有 99% 同源性，將導(dǎo)致靶標(biāo)切割。該載體包括來自內(nèi)源性 miRNA 的側(cè)翼和環(huán)序列，其指導(dǎo)從較長的 Pol II 轉(zhuǎn)錄本（miRNA 前體）中切除基因工程改造 miRNA。使用 Invitrogen 優(yōu)質(zhì) BLOCK-iT™ RNAi Designer，70% 以上的構(gòu)建體產(chǎn)生超過 70% 的敲低。基因工程改造 miRNA 的 Pol II 表達(dá)可實(shí)現(xiàn)：
o CMV 立即早期啟動(dòng)子的強(qiáng)表達(dá)，可選擇通過 MultiSite Gateway™ 重組使用組織特異性或其他調(diào)節(jié)啟動(dòng)子
o 與許多用于基因表達(dá)的 Invitrogen Gateway™ 目的 (DEST) 載體兼容；包括用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂、非分裂和原代細(xì)胞類型的慢病毒載體、用于單位點(diǎn)染色體整合的 Flp-In™ 系統(tǒng)以及替代報(bào)告基因融合構(gòu)建體
o 在同一轉(zhuǎn)錄本上表達(dá)一個(gè)以上的基因工程改造 miRNA，允許同時(shí)敲低多個(gè)基因并產(chǎn)生合成表型
工作原理
對(duì)于 miR RNAi 序列的高水平表達(dá)，pcDNA™6.2-GW/miR 載體包括 CMV 啟動(dòng)子（圖1）。只需在免費(fèi)的在線 BLOCK-iT™ RNAi Designer 中輸入 RefSeq 登錄號(hào)或核苷酸序列，該軟件即可設(shè)計(jì)出與目標(biāo)靶標(biāo)具有 99% 同源性的優(yōu)化 miRNA。使用快速連接方案將 miRNA 克隆至載體中并進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以立即表達(dá) miRNA。表達(dá)的 miRNA 在細(xì)胞核中通過內(nèi)源性細(xì)胞機(jī)制（包括 Drosha）加工，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中通過 Dicer 進(jìn)行進(jìn)一步加工（圖2）。然后將加工的 miRNA 摻入 RISC 中，在后者中其功能類似于 siRNA，并可導(dǎo)致 mRNA 靶標(biāo)切割。
對(duì)于多種表達(dá)選項(xiàng)，miRNA 盒（miR 側(cè)翼區(qū)和與目標(biāo)靶標(biāo)同源的 miRNA）可輕松地轉(zhuǎn)移至多種 DEST 載體中。這通過 Gateway™ 重組反應(yīng)發(fā)生，在該反應(yīng)中，將 miRNA 盒轉(zhuǎn)移至 pDONR™ 載體中（BP 反應(yīng)），然后轉(zhuǎn)移至 DEST 載體中（LR 反應(yīng)）。