實驗方法原理
離子交換色譜是將離子交換基因（CM、SP、Q、DEAE等）鍵合于一定的惰性載體（纖維素、交聯(lián)葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖等）之上，并以此作為固定相，依據(jù)樣品所帶電荷的不同，從而與固定相上的離子交換基團相互作用的程度不同而進(jìn)行分離的一種色譜方法。離子交換色譜技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體、多糖等的純化。
離子交換劑是在載體上鍵合了一些離子交換基團，而離子交換基團在水溶液中通過電離釋放出游離的離子，這些離子可帶正電或帶負(fù)電，可以被溶液中的其它帶相同電荷的離子取代，并對離子交換劑有較強的結(jié)合力。結(jié)合力的大小不僅受離子與離子交換劑之間作用力的影響，而且主要受離子濃度的影響，這個過程中的作用力是靜電引力，離子交換的原理是靜電相互作用。
蛋白質(zhì)在離子交換色譜上的保留時間取決于蛋白質(zhì)在相應(yīng)色譜條件下所帶靜電荷的多少，而蛋白質(zhì)所帶靜電荷的多少是由蛋白質(zhì)分子的pI和所處溶液環(huán)境的pH共同決定的。在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電荷；在堿性條件下，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。在陽離子交換柱上，只有pI大于流動相pH的蛋白質(zhì)在柱子上保留，而pI小于或等于流動相pH的蛋白質(zhì)不保留，即使它們的pI值彼此之間有差異，也都作為溶劑峰同時被直接沖洗出來。而被保留的蛋白質(zhì)出峰順序則是pI小的先出峰，pI大的后出峰。在陰離子交換柱上情況則恰恰相反。
過程分為四個階段：平衡-吸附-解吸附-再生，其中吸附和解吸附是主要階段，現(xiàn)以純化TNF過程中應(yīng)用的Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF為例說明。
實驗材料 TNF
試劑、試劑盒 Tris-HCl EDTAPB緩沖液硫酸銨透析
儀器、耗材 透析袋離心機離心管移液槍槍頭陰離子交換基質(zhì)Q-Sepharose FF蛋白檢測儀陽離子柱SP-Sepharose FF試管
實驗步驟
一、試劑的配制
1. 配制pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl含1mmol/L EDTA溶液（或其貯備液，臨用時稀釋即可）濾后使用。
2. 配制pH7.5 20 mmol/L的PB緩沖液，過濾后使用。
二、操作步驟
1. 樣品的預(yù)處理
2. 樣品的平衡
將實驗一中50%飽水硫酸銨沉淀、離心得到的上清液，置于透析袋中，于20～40倍體積的pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA的緩沖液中，4℃攪拌透析24 h，中間換透析液3～4次，4℃ 12 000 rpm離心15 min，收集上清，測定蛋白濃度，記錄體積。
3. 陰離子柱Q-Sepharose FF的平衡及上樣
取陰離子交換基質(zhì)Q-Sepharose FF裝柱，柱體積5.4×20 cm用pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA 緩沖液流洗平衡層析柱，調(diào)整好蛋白檢測儀的量程及記錄儀靈敏度。將收集的上清液以8 ml/min流速上樣。平衡緩液沖直至流出液吸光值恢復(fù)至基線。收集穿過峰，量體積，測蛋白含量。
4. 洗脫
洗脫液A為pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA緩沖液，洗脫液B為含終濃度為1 mol/L NaCl的A液進(jìn)行線性梯度洗脫（根據(jù)純化條件設(shè)定的純化工藝），收集各洗脫峰量體積，測蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE或進(jìn)行活性鑒定TNF所在峰。
5. 將活性峰用pH7.5 20 mmol/L PB透析24 h，中間換液3次。離心，取上清并量其體積，測蛋白濃度。
6. 陽離子柱SP-Sepharose FF的平衡及上樣
取陽離子交換基質(zhì)SP-Sepharose FF裝柱，柱體積2.5×10 cm，用pH7.5 20 mmol/L PB緩沖液流洗平衡層析柱，調(diào)整好蛋白檢測儀的量程及記錄儀的靈敏度，將透析、離心后的TNF的峰液以4 ml/min的流速上樣，用平衡液洗至基線，收集穿過峰，量體積，測蛋白濃度。
7. 洗脫
陽離子層析柱SP-Sepharose FF的洗脫液A為pH7.5 20 mmol/L PB，洗脫液B為含1 mol/L NaCl的A液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集各洗脫峰，量體積，測蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行SDS-PAGE或活性鑒定。
8. 后處理
進(jìn)行TNF的純度、活性等鑒定，按要求分裝加賦形劑冷凍干燥后制成一定效價的TNF產(chǎn)品。
收起
其他
一、離子交換劑的選擇
1. 劑型的選擇
在決定選擇離子交換劑的類別之前，先要了解所研究的生物大分子保持生物活性和可溶解性的pH范圍，然后根據(jù)其等電點以及其在上述pH范圍內(nèi)的電泳行為觀察大分子的帶電情況，再據(jù)此選擇合適的離子交換劑。具體方法是；在流動相pH條件下進(jìn)行電泳，向陽極泳動的蛋白質(zhì)，可被陰離子交換劑吸附，因此，選擇陰；反之，向陰極泳動的蛋白質(zhì)，可被陽離子交換劑吸附，應(yīng)選擇陽。
通常，弱離子交換劑用來分離高靜電作用力的蛋白質(zhì)，強離子交換劑用來分離低靜電作用力的蛋白質(zhì)。
2. 粒度的選擇
離子交換劑粒度的大小對吸附量的影響不大，主要是對分辨率和流速產(chǎn)生影響。用粗顆粒填料填充的柱子不緊密，顆粒間隙大，容易引起區(qū)帶擴散；由于顆粒大，同樣吸附量的粗顆粒占柱床體積大，使形成的峰變寬。這些都會導(dǎo)致色譜分辨率下降。但是顆粒大流速快，分離速度快，使純化時間縮短。細(xì)顆粒填料可填充成為致密的吸附床，分辨率高，但流速慢，柱壓高。我們可根據(jù)自己工作的需要進(jìn)行選擇，如果為保持欲分離組分的生物學(xué)活性需要縮短分離時間，在大量制備基因工程產(chǎn)品時，可選用粗顆粒。如果要得到高分辨率，可選用超細(xì)顆粒。通常我們在實驗室工作中采用的是細(xì)或中等粗細(xì)的顆粒。
3. 緩沖液的選擇
在中，選擇合適的緩沖體系，保持準(zhǔn)確的流動相pH值更顯得尤為關(guān)鍵。選擇緩沖液時應(yīng)滿足以下要求：
（1）不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不影響蛋白的活性。
（2）對人體無毒無害。
（3）緩沖容量大，在所選擇pH范圍內(nèi)有足夠緩沖能力的前提下，離子濃度越小越好。
（4）使用陽離子交換時應(yīng)用陰離子緩沖劑，使用陰離子交換時應(yīng)用陽離子緩沖劑，以避免不必要的離子交換過程。
（5）不干擾對分離物的鑒定。
目前陽常用緩沖液離子有烷基胺、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑、Tris，吡啶等，其中Triszui為常用；陰常用的緩沖液離子有醋酸鹽、*酸鹽、檸檬酸鹽、*，磷酸鹽等，其中醋酸鹽和磷酸鹽zui為常用。
在實際工作中，我們根據(jù)不同的流動相 pH條件來決定采用何種緩沖體系。例如：流動相pH3-5時，我們采用甲酸銨緩沖液；流動相pH4-6時，我們采用醋酸鈉或*緩沖液；流動相pH6-8時，我們采用磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液。此外，Tris-鹽酸緩沖液的pH范圍為7-9，Tris-磷酸緩沖液的pH范圍為6-9，我們都經(jīng)常選用。
4. 洗脫方式的選擇
洗脫方式有三種：一是改變緩沖液pH，使蛋白質(zhì)從吸附狀態(tài)變?yōu)榻馕綘顟B(tài)。如在陰中，通過降低流動相pH使吸附在柱子上的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電，從而達(dá)到解吸附，在陽中則是通過升高流動相pH的方法達(dá)到解吸附；二是增加緩沖液的離子強度，將吸附強的分子從離子交換劑上替換下來；三是緩沖液pH和離子強度同時改變。無論哪一種方法，都可用階段洗脫和梯度洗脫兩種方式進(jìn)行。
階段洗脫是用幾個不同pH緩沖液或幾個不同鹽濃度的緩沖液逐步進(jìn)行洗脫。即pH和離子強度變化不連續(xù)。而在梯度洗脫中，緩沖液的洗脫能力是連續(xù)增加的，由于后者分辨率更好，因此被廣泛采用。
在經(jīng)典色譜中需用梯度混合器來制造線性梯度，梯度混合器是由兩個容器構(gòu)成，兩個容器安放在同一個水平上，一個盛起始緩沖液，另一個盛含較高離子強度或不同pH的緩沖液。二者用管子相連，以保持溶液的流體靜力平衡。當(dāng)緩沖液從*個容器流入柱內(nèi)，第二個容器的緩沖液進(jìn)入*個容器自動補足，使緩沖液形成梯度。
現(xiàn)在許多中低壓色譜儀器（如Waters，Pharmacia等公司的一些產(chǎn)品）和液相色譜一樣可以用計算機控制雙泵自動配制流動相，很容易地獲得直線或非直線、連續(xù)或非連續(xù)的梯度模式，以滿足不同的分離需要。
通常對線性梯度的要求是：
（1）洗脫液的總體積應(yīng)足夠大，一般梯度至少要四倍床體積，使分離的各個峰有較好的分辨率；
（2）梯度上限要有足夠強的洗脫能力，使吸附的zui緊密的物質(zhì)也能夠從柱子上被洗脫下來；
（3）梯度的斜率不應(yīng)太大，以確保各峰能夠分開，但又不應(yīng)太小，以免峰形過寬甚至形成拖尾；一般認(rèn)為，梯度體積越大，梯度變化越緩，則分辨率越好。
二、實驗操作
1. 填料的預(yù)處理
2. 裝柱
不同于凝膠色譜，柱子通常較為短小，對于一般工作，通常選長度為10-40cm的柱已足夠。柱的直徑按照欲分物質(zhì)的數(shù)量來選定。對于很復(fù)雜的混合物和進(jìn)行精細(xì)分析是用細(xì)長的柱，分辨率較好；對于初步分離可用較粗、容量較大的柱。裝好的柱子用起始緩沖液充分平衡后上樣。
3. 上樣
柱必須充分平衡后方可上樣。上樣量取決于色譜柱的交換容量，一般為交換容量的70-80%，上樣體積可以不受限制。通常低濃度樣品上樣可達(dá)床體積的幾倍到幾百倍。這一點對較稀的樣品極為有利，可以同時起到分離和濃縮的雙重作用，可謂一舉兩得。但用于分析時，為了提高分辨率，上樣量體積適當(dāng)減小。用于分離的樣品溶液的離子強度和pH值必須與起始緩沖液（即流動相A液）一致，如不一致，應(yīng)進(jìn)行緩沖液轉(zhuǎn)換，可通過透析或凝膠色譜來完成。
4. 洗脫、樣品收集
加樣后用足夠量的起始緩沖液洗滌除去不吸附的物質(zhì)，然后再進(jìn)行洗脫。洗脫可選擇不同的方法，用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的樣品組分經(jīng)紫外檢測器實時檢測（檢測波長一般為280 nm），用分部收集器或手工收集。
5. 再生
樣品洗脫完畢后要進(jìn)行再生，以除去仍然結(jié)合在柱子上未*洗下的一些蛋白質(zhì)，通常用*流動相B液再洗脫1個柱體積即可。
6. 平衡
再生后的柱子欲再次進(jìn)樣需重新進(jìn)行平衡，平衡一般用*A液（即0%B液）洗滌柱子至少四個柱體積。
7. 保存
柱子不用時應(yīng)用強洗脫劑洗去結(jié)合于柱子上的雜質(zhì)，然后再用蒸餾水*清洗后加抑菌劑保存。
