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當(dāng)前位置:上海谷研實(shí)業(yè)有限公司>>技術(shù)文章>>ELISA雙抗體夾心法
一、雙抗體夾心法原理:
ELISA雙抗體夾心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體,然后和待檢血清中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物,洗滌后再加酶標(biāo)記抗體,與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物,加底物顯色,判斷抗原含量。以檢測(cè)HbsAg為例。
二、雙抗體夾心法材料:
酶標(biāo)抗體(HRP-抗HBs-IgG)、抗HBs-IgG、待檢血清
包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB
稀釋液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液
底物液 0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)5.14 ml,0.05 mol/L枸櫞酸(10.5g/L)4.86 ml混勻,加入鄰苯二胺(OPD)4 mg,置棕色小瓶中,臨用時(shí)加30% H2O2 4.0μl,混勻。
終止液 2 mol/L H2SO4
溫箱、酶標(biāo)反應(yīng)板、酶標(biāo)分光光度計(jì)
三、雙抗體夾心方法:
(1). 包被 取包被液適當(dāng)稀釋的抗HBS-Ig 0.1 ml,加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中。加蓋,4℃ 24h。次日用洗滌液充分洗滌3次,甩干。
(2). 各孔內(nèi)加不同稀釋倍數(shù)的待檢血清0.1 ml,同時(shí)加陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清,置43℃溫箱60 min,移去液體。同前法洗滌3次,甩干。
(3). 各孔內(nèi)加稀釋HRP-抗HBs-IgG 0.1 ml,置43℃溫箱60 min。移去液體,同前法洗3次,甩干。
(4). 各孔加底物液0.1 ml,置黑暗處20 min。
(5). 各孔內(nèi)加2 mol/L H2SO4 0.05 ml,終止反應(yīng)。
四、檢測(cè)結(jié)果:
(1). 目測(cè)法 陽(yáng)性孔呈桔黃色,陰性孔無色或極淺黃色。
(2). 比色法 用酶標(biāo)分光光度計(jì)測(cè)A492nm,計(jì)算P/N值(為待測(cè)血清A492nm和陰性對(duì)照A492nm的比值)。如P/N2.1,結(jié)果為陽(yáng)性,否則為陰性。
elisa簡(jiǎn)便、敏感、特異。并酶標(biāo)記抗體試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長(zhǎng)、因此推廣很快,ELISA雙抗體夾心法,但僅適用于二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原的檢測(cè)。
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