（一）樣品的制備

    在這部分內(nèi)容中，主要描述了直接收集細(xì)胞內(nèi)總蛋白的方法、用免疫沉淀獲得蛋白質(zhì)的方法，及其隨后用雙向電泳分離、用銀染或West-ern印跡檢測(cè)的樣品制備。如果采用了其他的檢測(cè)方法，如GST或His-pul-down時(shí)，可以類(lèi)似地制備等電聚焦的樣品，然后再參照本章部分2中步驟進(jìn)行后續(xù)的樣品制備。在整個(gè)操作過(guò)程中，應(yīng)該佩戴手套，以避免任何可能的外來(lái)性蛋白污染。

    “直接收集細(xì)胞內(nèi)總蛋白”進(jìn)行雙向電泳分析與“免疫沉淀等其他操作獲得的蛋白質(zhì)樣品”進(jìn)行雙向電泳在本質(zhì)原理上沒(méi)有區(qū)別，但在樣品制備過(guò)程中的處理有所不同。因?yàn)殡p向電泳進(jìn)行時(shí)，上樣體系中要求低鹽（是無(wú)鹽，以免干擾電泳進(jìn)行）。所以前者在一開(kāi)始處理時(shí)，就要求用雙向電泳的裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解；而后者在細(xì)胞裂解時(shí)無(wú)特殊處理，而在免疫沉淀后獲得的蛋白質(zhì)樣品就需要經(jīng)過(guò)低鹽、無(wú)去污劑的緩沖液洗滌處理，然后再進(jìn)行后續(xù)電泳。

1.直接收集細(xì)胞內(nèi)總蛋白進(jìn)行雙向電泳

    根據(jù)試驗(yàn)需要，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)或相應(yīng)處理（如不同的藥物刺激或狀態(tài)）。按照我們的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，一般的貼壁細(xì)胞讓其生長(zhǎng)到90%滿(mǎn)度以上時(shí)提取細(xì)胞蛋白較好。具體細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)不同而異，如P19細(xì)胞，175cm2的培養(yǎng)瓶（細(xì)胞數(shù)為108數(shù)量級(jí)）可以收獲8--10mg的總蛋白。而一次2D電泳（指能滿(mǎn)足后續(xù)考染、質(zhì)譜分析）需要的蛋白量是0.8--1mg。而且，由于上樣體系總體積的限制，zui終獲得的溶液蛋白濃度不能低于8mg/ml。（Ramsbyetal.1994；Tayloretal.20）

（1）細(xì)胞的清洗

    在加入裂解液裂解細(xì)胞之前，應(yīng)充分洗滌細(xì)胞，盡量去除培養(yǎng)液中的蛋白和其他成分，同時(shí)又應(yīng)避免引入過(guò)多的離子。選擇使用低離子強(qiáng)度的等滲緩沖液作為細(xì)胞漂洗液（washsolution）。

    使用中等滲的*溶液漂洗細(xì)胞，漂洗液使用以前在4℃冰箱預(yù)冷。加漂洗液時(shí)讓其從培養(yǎng)瓶側(cè)壁流下，避免產(chǎn)生的沖力使細(xì)胞從瓶壁上脫落。輕巧地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使漂洗液流過(guò)整個(gè)培養(yǎng)瓶的內(nèi)壁，漂洗3耀4遍。zui后一遍漂洗完后，盡量倒干漂洗液，然后將瓶口向上側(cè)傾插入冰中預(yù)冷，細(xì)胞貼壁一面應(yīng)*與冰接觸。放置15min，讓殘余的漂洗液流到瓶底一角，用巴斯德管將其盡量吸干。

（2）細(xì)胞的裂解，蛋白提取

    新鮮配置細(xì)胞裂解液（lysisbufer），同時(shí)加入適量 DNAseI、RNAseA（終濃度0.5mg/ml）。如：底面積為75cm2的培養(yǎng)瓶加入裂解液約30μl（裂解液體積為細(xì)胞沉淀體積的3耀5倍），讓其流過(guò)整個(gè)細(xì)胞貼壁面，將培養(yǎng)瓶置于冰上放置10耀20min裂解，用細(xì)胞刮子將裂解后的細(xì)胞刮下吸入1.5ml的Ependorf管中，冰上超聲處理（具體超聲條件需要根據(jù)不同的細(xì)胞和儀器進(jìn)行優(yōu)化，比如我們的經(jīng)驗(yàn)：輸出功率60--10W，超聲3--5s，間歇60s，共3--10個(gè)循環(huán)），超聲后細(xì)胞懸液應(yīng)變得澄清透亮。然后4℃，140rpm離心40min，保留上清。上清取樣立即進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，余下的蛋白樣品根據(jù)蛋白濃度的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行分裝（如1毫克/支），置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.免疫沉淀等其他操作后獲得的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳

（1）細(xì)胞裂解

根據(jù)試驗(yàn)需要，培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行相應(yīng)處理。

1）用PBS洗滌細(xì)胞三次，刮下貼壁的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至一個(gè)EP管中。

2）細(xì)胞180g離心3s，去除PBS。

3）加入裂解緩沖液（每1×106個(gè)細(xì)胞加入大約10μl裂解液），吹打混勻，冰上孵育15min。

4）細(xì)胞于4℃，180g離心15min。

5）上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中。

6）采用Bradford等方法分析上清中的蛋白濃度。

（2）相互作用蛋白的分離

    用共價(jià)交聯(lián)至Sepharose珠子的抗體進(jìn)行免疫沉淀。在大規(guī)模制備蛋白復(fù)合物時(shí)，zui常采用的是固定至ProteinA或ProteinG的Sepharose珠子的抗體。過(guò)量的免疫球蛋白會(huì)影響蛋白質(zhì)的等電聚焦以及二向分離。將抗體固定至珠子能克服這些問(wèn)題。

1）裂解物的預(yù)清除：用細(xì)胞裂解液洗滌ProteinG或ASepharose珠子，共3次（每個(gè)樣品用20μl珠子）。商品化的Sepharose珠子常以50%懸液的形式保存在20%乙醇中。在20μlProteinG或ASepharose珠子中加入0.5--2mg的蛋白裂解物，4℃搖床孵育1h。該步驟可以移除與珠子非特異性結(jié)合的蛋白。

2）離心珠子，將經(jīng)過(guò)預(yù)清除的裂解物轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的 EP管中，EP管中預(yù)先加有10耀20μl抗體交聯(lián)的珠子。4℃搖床孵育2h或過(guò)夜。

3）用裂解液洗珠子，共3次，并用低鹽無(wú)去污劑的緩沖液（10mmol/LNaCl，50mmol/LTris-HCl pH7.4，5mmol/LEDTA）洗滌一次。盡量移除殘余的緩沖液。

4）室溫加入 含0.01%溴酚藍(lán)（或吸取少許）和2%pH3--10的兩性電解質(zhì)的2D用裂解液。對(duì)于18cm長(zhǎng)的IPG膠條，終體積應(yīng)該為350μl（或根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明）。如果使用的是管狀膠，終體積不一定需要調(diào)整至350μl。zui終的上樣體積取決于膠和玻璃管頂端的間距。用2D裂解液來(lái)調(diào)整體積。將樣品混勻，室溫孵育幾分鐘，然后離心。將上清上樣至*向凝膠。