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上海酶聯(lián)生物研究所

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省時(shí)的高通量抗體篩選的均相抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法

閱讀：517發(fā)布時(shí)間：2012-9-11

以抗體技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫檢測應(yīng)用和相關(guān)的疾病治療領(lǐng)域如癌癥，自發(fā)免疫紊亂等一直推動著抗體篩選研究的發(fā)展。單克隆抗體是會由特定的細(xì)胞系分泌到上清液中，而對上清液的篩選則成為了藥物研發(fā)的核心領(lǐng)域。

均相結(jié)合實(shí)驗(yàn)

盡管ELISA和流式細(xì)胞儀等傳統(tǒng)手段被廣泛應(yīng)用，但是這兩種檢測手段都存在很多的局限性，特別是對細(xì)胞表面低豐度抗原的檢測。同時(shí)，這兩種平臺需要很繁瑣的洗板和孵育的步驟而且耗費(fèi)大量細(xì)胞和時(shí)間才能獲取數(shù)據(jù)。為了解決這些技術(shù)瓶頸，我們開發(fā)了mirrorball這個(gè)高靈敏度檢測平臺和“即混即讀”的實(shí)驗(yàn)方案，這樣就大幅度的提高了抗體篩選的通量并且避免了繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟。您所需要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)僅僅是將所有的反應(yīng)物一次性的加入到孔中并孵育一段時(shí)間。這里待檢測的可以是結(jié)合在微球上的可溶性抗原也可以是細(xì)胞表面表達(dá)的抗原，一旦反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，那么結(jié)合了一抗的珠子和細(xì)胞可以很快的通過熒光標(biāo)記的二抗來檢測到。由于mirrorball的這種高靈敏度特性，使得我們可以比流式和傳統(tǒng)ELISA更早的檢測樣品，并且只需要5ul左右的待測樣品。均相反應(yīng)體系可以大幅度的減少試劑的消耗，特別適用于研究昂貴和低豐度的抗原。mirrorball的數(shù)據(jù)掃描和獲取

微孔板進(jìn)行掃描時(shí)使用488nm和640nm的激發(fā)光。使用TTP LabTech公司的閾值算法和兩種形態(tài)熒光參數(shù)，每孔中的細(xì)胞都會 “on-the-fly”。。而使用mirrorball的圖像Cellista™軟件，我們可以進(jìn)行全景掃描，得到數(shù)據(jù)可視化中的各種數(shù)據(jù)圖形（包括直方圖或散點(diǎn)圖，3D熒光強(qiáng)度分布圖）和整個(gè)微孔的圖片。

ABI 8200的數(shù)據(jù)掃描和獲取

使用640 nm激光掃描樣品，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光總強(qiáng)度檢測，數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel文件和處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)僅僅收集了孔中心1 mm2面積區(qū)域。

數(shù)據(jù)結(jié)果

為了比較mirrorball和ABI 8200在EGFR檢測靈敏度方面的差異性，將A431細(xì)胞與梯度稀釋的EGFR一抗以及AlexaFluor647標(biāo)記的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。在用mirrorball分析時(shí)，用CFSE對細(xì)胞進(jìn)行染色，預(yù)先定位細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞量為384孔板每孔2000個(gè)。對于ABI的8200， A431細(xì)胞量為每孔8000個(gè)接種。

均相抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的分析

mirrorball和ABI 8200 FMAT 都在設(shè)計(jì)上融入了很多適用于均相結(jié)合實(shí)驗(yàn)的特性。通過使用激光作為激發(fā)光源和光電倍增管作為檢測裝置，這使得它們能夠檢測到低親和力的抗體和低豐度的抗原的結(jié)合。兩個(gè)系統(tǒng)都在光路設(shè)計(jì)上zui大程度的降低了背景熒光并在掃描讀數(shù)的時(shí)候大幅度的提高了信噪比。在這個(gè)應(yīng)用介紹里我們特別的比較了兩個(gè)平臺 mirrorball和ABI 8200 在通過細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗體篩選時(shí)的性能優(yōu)異性。通過對比，我們展示了mirrorball的多重?zé)晒鈾z測能力，這使多重抗原標(biāo)記并同時(shí)檢測成為了可能。

方法

細(xì)胞系和培養(yǎng)方法

在這項(xiàng)研究中，比較了mirrorball和ABI8200系統(tǒng)在進(jìn)行A431細(xì)胞EGFR抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)時(shí)的。 A431細(xì)胞在EMEM培養(yǎng)（EBSS）（Sigma公司）含10%胎牛血清，2mM*（Sigma公司），1X非必需氨基酸（NEAA）（Sigma）和100 U / mL*以及100 U / ml*。 A431細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合度時(shí)用0.25%*和EDTA收集，洗凈懸浮在培養(yǎng)基中。除非另有說明，培養(yǎng)試劑均購自Life Technology。

抗體和試劑

檢測抗體，鼠抗人表皮生長因子抗體（抗EGFR抗體），購自Merck Chmicals Ltd（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor647 （#A21235）由Life Technologies公司提供。

CFSE標(biāo)記

5（6） - 羧基二乙酸N -琥珀酰亞胺酯（CFSE）（Sigma公司）配置為100mM在DMSO溶液里。 CFSE（10nM）被添加到細(xì)胞里并在室溫中孵育10分鐘。用4%FBS的PBS（2ml）終止反應(yīng)。進(jìn)一步孵化，于37° C下10分鐘后，細(xì)胞1000 x g離心5分鐘。

EGFR實(shí)驗(yàn)

抗EGFR抗體在培養(yǎng)基中梯度稀釋，并添加20ul到384孔板中（Costar#3712）。對于mirrorball系統(tǒng)，暫停用CFSE標(biāo)記A431細(xì)胞含有1 ×105個(gè)細(xì)胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。對于ABI的8200平臺，準(zhǔn)備A431細(xì)胞的懸浮液包含4× 105細(xì)胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有熒光二抗的細(xì)胞懸液在37℃，孵育2小時(shí)。分別在mirrorball和ABI8200平臺上進(jìn)行掃描并測定結(jié)合有EGFR抗體的細(xì)胞數(shù)量。zui后，mirrorball和ABI8200的濃度分別為2000細(xì)胞/孔和8000

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