細(xì)胞/組織線粒體內(nèi)鈣離子熒光染色試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

細(xì)胞/組織線粒體內(nèi)鈣離子熒光染色試劑是一種旨在通過(guò)線粒體鈣離子特異性熒光探針Rhod-2-AM，進(jìn)入線粒體后，與鈣離子結(jié)合，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光現(xiàn)象，來(lái)分析細(xì)胞/組織線粒體中總鈣離子的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞或組織（動(dòng)物、人體等）內(nèi)線粒體鈣離子的染色檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對(duì)神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中線粒體鈣離子在調(diào)節(jié)線粒體代謝、保持線粒體的ATP產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞需求，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。Rhod-2-AM，羅丹明123（rhodamine 123）的衍生產(chǎn)物，進(jìn)入細(xì)胞受到酯酶解離，同時(shí)其正電荷特性，特異性地聚集在線粒體里，與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光，由此用于測(cè)定線粒體內(nèi)鈣離子水平。在熒光顯微鏡下，激發(fā)波長(zhǎng)550nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm，觀察紅色熒光現(xiàn)象。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）      40毫升

染色液（Reagent B） 30微升

介導(dǎo)液（Reagent C）     600微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實(shí)驗(yàn)步驟

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 設(shè)定好（共聚焦）熒光顯微鏡（22℃）：激發(fā)波長(zhǎng)550nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm
• 測(cè)定開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導(dǎo)液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

二、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測(cè)

1）細(xì)胞樣品染色

1． 準(zhǔn)備1個(gè)待測(cè)的細(xì)胞爬片樣品

• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述染色工作液到樣品上，覆蓋樣品表面
• 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照
• 小心移去樣品上的染色工作液
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)550nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm（線粒體鈣離子呈現(xiàn)紅色）

2）組織樣品染色

• 取出待測(cè)的5至10微米厚的冰凍切片（注意：使用快速冷凍處理－snap frozen的冰凍切片，不宜使用包埋處理）
• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆蓋切片樣品表面
• 小心移去切片樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述染色工作液到切片樣品上，覆蓋切片樣品表面
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去染色液
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上100微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)550nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm（線粒體鈣離子呈現(xiàn)紅色）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光分析
• 如果背景染色過(guò)高，可以調(diào)整染色工作液使用劑量（1：100至1：1000容量比）
• 本公司提供系列鈣生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感