ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)抗體的制備方法
ELISA試劑盒途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，通常不宜選用靜脈打針。
不一樣個(gè)別對(duì)共同抗原的反應(yīng)性不一樣，而且不一樣抗原發(fā)作免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在打針抗原的一起，參與能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以影響機(jī)體發(fā)作較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。
免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需求量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴參與等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼承研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不分散停止。
交叉反應(yīng)率低，標(biāo)明抗血清的特異性好，反之則特異性差。
收集的血液置于室溫下1h支配，凝聚后，置4℃下，過(guò)夜（切勿冰凍）分出血清，離心，4000rpm，10min。
取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，二是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血。加強(qiáng)免疫時(shí)用不*佐劑，初度免疫時(shí)皮下打針百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時(shí)不必打針百日咳疫苗。
在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后儲(chǔ)存。
取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。
避免丟掉抗原，亦可用一打針器裝抗原液，另一打針器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管聯(lián)接，然后二者往復(fù)重復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能*乳化。
每2～3周加強(qiáng)免疫一次。
制作方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保留備用。
ELISA試劑盒特異性是以交叉反應(yīng)率來(lái)標(biāo)明的。
交叉反應(yīng)率通常是用比賽抑制曲線來(lái)判定的。
若用兔，用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。
家兔是zui常用以發(fā)作抗體的動(dòng)物，因此這兒首要談?wù)撏醚氖占?br />頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰臥，固定于兔臺(tái)，剪去頸部的毛，切開皮膚，顯露頸動(dòng)脈，插管，放血。
不一樣濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做比賽抑制曲線，計(jì)算各自的聯(lián)絡(luò)率（B/T或B/B0），求出各清閑IC50時(shí)的濃度，按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。二禮拜后，可在另一耳放血。
此法可重復(fù)屢次放血。
作免疫用的動(dòng)物有哺乳類和禽類，首要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。
在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢查抗體效價(jià)。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血，鼠等小動(dòng)物取血可參看有關(guān)材料。
剪去耳緣的毛，用少數(shù)二甲苯涂改耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)大、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，敏捷切開動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml。
抗原劑量，初度劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為初度劑量為1/4支配。
C冰箱保留。檢查合格后即以其中一打針器作打針用。
佐劑除了延伸抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，添加抗原影響效果外，更首要的是，它能影響網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使介入免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，推進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互效果，然后增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的發(fā)作。
ELISA試劑盒未抵達(dá)預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿足時(shí)停止。
會(huì)員1.png)