供體細(xì)胞類型和基因型對小鼠體細(xì)胞克隆效率的影響
實驗步驟
1. 供體細(xì)胞準(zhǔn)備
卵丘細(xì)胞從2-4月齡成熟母鼠獲得，未成熟支持細(xì)胞從0-5日齡未成熟雄鼠獲得。卵丘細(xì)胞通過透明質(zhì)酸酶脫顆粒細(xì)胞獲得。未成熟睪支持細(xì)胞獲得方法如下：
取下的小鼠睪用0.1mg/ml膠原酶與0.01mg/ml脫氧核糖核酸酶37℃處理30min，然后用0.2mg/ml*37℃處理5min，去睪懸液即可。睪懸液用含4mg/ml BSA的PBS洗一下就可用于顯微注射了。未成熟睪細(xì)胞根據(jù)其體積與形態(tài)即可確認(rèn)。
2. 受體卵母細(xì)胞的獲得
8-10周齡BDF1雌鼠常規(guī)超排獲得卵母細(xì)胞。7.5IU/只eCG，48h后7.5IU/只hCG。hCG注射后15h脫頸處死小鼠獲得卵母細(xì)胞。(培養(yǎng)箱條件：37.5℃，6.2%CO2。)
3. 核移植
MII期受體卵母細(xì)胞在37℃條件下去核，操作液為含5µg/ml CB的Hepes-KSOM。BDF1染色體在Nomarski光學(xué)鏡下能夠很容易的辨認(rèn)，利用Piezo裝置將紡錘體及其周圍少量胞質(zhì)取出。去核的卵母細(xì)胞在KSOM液中孵育30min-2h使其胞膜*恢復(fù)。供體細(xì)胞在室溫下、Hepes-KSOM液中利用Piezo裝置注入去核卵母細(xì)胞中。供體細(xì)胞的核沒有必要從細(xì)胞質(zhì)中*弄出來，因為卵丘細(xì)胞與未成熟睪支持細(xì)胞的胞膜都是軟的，在注射時它們的胞膜很容易破。注射了體細(xì)胞的卵母細(xì)胞在KSOM中孵育1-2h使體細(xì)胞的染色質(zhì)凝集。重構(gòu)胚在無Ca2、含3mM SrCl2 與5µg/ml CB的KSOM液中孵育1h，然后在含5µg/ml CB的KSOM液中孵育5h，zui后移入單純的KSOM液中培養(yǎng)72h。
4. 胚胎移植
72h后發(fā)育到桑囊胚階段的重構(gòu)胚移植入8-12周齡假孕3d的ICR雌鼠(小鼠見栓當(dāng)天稱為*)子宮中。8-10枚胚胎移入一側(cè)子宮(16-20枚胚胎移入一種受體小鼠)。在第20d時，檢測受體小鼠中成活的胚胎，活著的小鼠讓泌乳ICR雌鼠哺乳。
5. 試驗設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)分析
在試驗1中，利用實驗室小鼠品系檢測供體細(xì)胞類型與基因型對看了胚胎發(fā)育的影響。在試驗2中，檢測了野生型基因型(JF1)與129基因型結(jié)合后的基因型克隆小鼠其發(fā)育能力是否比單純的JF1克隆小鼠的發(fā)育能力強(qiáng)。
