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γ-氨基丁酸(GABA)含量試劑盒,微板法

γ-氨基丁酸(GABA)含量試劑盒,微板法

1 γ-氨基丁酸（GABA）含量試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS6011W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 4-氨基丁酸（GABA）廣泛分布在動(dòng)植物體中。在動(dòng)物體內(nèi) GABA 幾乎只存在于神經(jīng) 組織中。在植物中如豆屬、參屬、中草藥等的種子、根莖和組織液中都含有 G A B A， 且與植物的環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。 4-氨基丁酸（GABA）在堿性溶液中與次氯酸鹽和*酚反應(yīng)生成藍(lán)綠色物質(zhì)，通過(guò)檢 測(cè)該有色物質(zhì)在 645nm 波長(zhǎng)處的值，即可得出樣本中 GABA 的含量。 二、試劑盒的組分與配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 2mL×1 支 4℃保存 臨用前取出0.13mL試劑二至一支 新 EP 管中，再向其中加入 1.87mL 蒸餾水混勻做為試劑二使用（該 液體一周內(nèi)用完）。 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液槍、水浴鍋、離心機(jī)、研缽、蒸餾水。 四、γ-氨基丁酸（GABA）含量測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱(chēng)取約 0.1g 組織樣本加入研缽中，加入 1mL 提取液，在冰上進(jìn)行勻漿， 12000rpm，4℃或室溫離心 10min，取上清液待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s， 重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接測(cè)定，若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 645 nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。則試劑一和二可按照 30:200 的比例預(yù)先配制成混合液 （用多少配多少，現(xiàn)配現(xiàn)用），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 空白管（僅做一次） 樣本 50 蒸餾水 50 混合液 230 230 試劑三 100 100 混勻，沸水浴（95-100℃）10min，冰浴至室溫，若渾濁需2 12000rpm 離心 5min，取澄清的 200μL 至 96 孔板中，于 645nm 處讀取各管的 A 值。△A=A 測(cè)定-A 空白。 【注】1.若測(cè)定管的 A 值大于 1，則需將樣本進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄓ谜麴s水稀釋?zhuān)?，稀釋倍?shù) D 需代入計(jì) 算公式重新計(jì)算。 2.若△A 值低于 0.01，則可增加樣本取樣量 W（如增至 0.2g）或增加樣本加樣量 V1（如 由 50μL 增至 100μL，則混合液和試劑三均各自減少 25μL），則 W 和 V1 代入計(jì)算公式重 新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0576x - 0.0236，x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量(μg)，y 為吸光值ΔA。 2、按樣本質(zhì)量計(jì)算： GABA 含量(μg/g 重量)=[(ΔA+0.0236)÷0.0576]÷(W×V1÷V)×D =347.2×(ΔA+0.0236)÷W×D 3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： GABA 含量(μg/104 cell)=[(ΔA+0.0236)÷0.0576]÷(500×V1÷V)×D =0.7×(ΔA+0.0236)×D 4、液體中 GABA 含量計(jì)算： GABA 含量(μg/mL)=[(ΔA+0.0236)÷0.0576]÷V1×D=347.2×(ΔA+0.0236)×D V---提取液體積，1mL； V1---樣本加入體積，0.05mL； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； W---樣本取樣質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量，萬(wàn)。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（5mg/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品臨用前甩幾下使粉體落入底部，再加 2mL 蒸餾水溶解（兩天內(nèi)用 完）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際樣本 來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照測(cè)定管的加樣體系操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。