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硝酸還原酶(NR)試劑盒,微板法

硝酸還原酶(NR)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 硝酸還原酶（Nitrate Reductase，NR）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS2040W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 硝酸還原酶（NR，EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是一種誘導(dǎo)酶。是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn) 化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，與作物有效吸收和利用氮素肥料有關(guān)，是植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的 指標(biāo)之一，也可作為品種選育的指標(biāo)之一。 本試劑盒采用離體法檢測，通過硝酸還原酶催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽進 一步與磺胺及α-萘胺定量生成紫紅色偶氮化合物；顏色深淺與硝酸還原酶活性呈正比， 通過檢測該物質(zhì)于 530nm 的吸光值，即可得出硝酸還原酶的活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入試管底部，再加 10mL 提取液溶解，仍 4℃保存。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，每支分別 加 1mL 蒸餾水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑三 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，每瓶再加 6mL 蒸 餾水，于 70℃水浴約半小時至*全溶解備用。 試劑四 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 使用前需超聲至*全溶解。 標(biāo)準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機、研缽、冰和蒸餾水。 四、硝酸還原酶（NR）活性測定： 由于硝酸還原酶是個誘導(dǎo)酶，酶活性大小與取樣前是否誘導(dǎo)有關(guān)（施過氮肥、光照充足 條件下所取植物樣本即為誘導(dǎo)處理樣本），因此務(wù)必取 2 個樣本做預(yù)測定，依據(jù)預(yù)測定結(jié)果選 擇是否進行誘導(dǎo)處理。 酶的誘導(dǎo)（選做）：取適量新鮮樣本洗凈，放入盛有 1mg/mL 硝酸鉀溶液（自備）的 燒杯中（淹沒即可），浸泡 2h，取出樣本用濾紙吸干后，-20℃冷凍 30min，取出樣本再 用濾紙吸干后即可按照樣本制備步驟制備待測上清液。 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿(難磨樣本可用石英砂 研磨，不能用液氮研磨)。12000rpm，4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測。 【注意】提取過程操作應(yīng)迅速，并且在 4℃下進行。若樣本顏色較深（如植物葉片），可在樣本制備過 程中增加除色素步驟：取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 的 80%乙醇冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復(fù) 2 次。最后向離心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液； 超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，300W，超聲 3s，間隔 7s，總時間 3min）；12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、上機檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 530nm。 ② 反應(yīng) mix 的制備：已*全溶解的試劑三和試劑四按照 1:1 的比例混合（每次可根據(jù)本試劑盒僅供科研使用 2 檢測樣本數(shù)量現(xiàn)用現(xiàn)配），試劑三和四*全溶解后于 4℃存放一段時間會有沉淀析 出，每次配置反應(yīng) mix 前需重新*全溶解。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 20 試劑一 70 試劑二 30 蒸餾水 100 30℃（如水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱）避光培養(yǎng) 30min 反應(yīng) mix 100 100 混勻，30℃避光反應(yīng) 15min，立即于 530nm 處讀取吸光值 A， △A=A 測定-A 對照（每個樣本需做一個自身對照）。 【注】：1.若△A 值低于 0.005，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 50μL，則試劑一相應(yīng)減少）， 則改變后的 V1 需代入公式重新計算。 2. 若整個反應(yīng)結(jié)束后有沉淀渾濁現(xiàn)象，可在 EP 管中重新按照上表加入相應(yīng)試劑量，加完反 應(yīng) mix 于 30℃避光反應(yīng) 15min 后，室溫 12000rpm 離心 3min，取等體積的上清液至 96 孔板中讀值。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準曲線方程：y = 0.7244x-0.0002；x 為標(biāo)準品摩爾濃度（μmol/mL），y 為△A。 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每小時每克鮮重樣品中催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。 NR(nmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T=2761×(△A+0.0002)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每小時每毫克組織蛋白催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。 NR(nmol/h/mg prot)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T=2761×(△A+0.0002)÷Cpr 4、按細菌或細胞密度計算： 單位定義：每小時每百萬細菌或細胞催化產(chǎn)生 1nmol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。 NR(nmol/h/104 cell)=[(△A+0.0002)÷0.7244×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T=5.52×(△A+0.0002) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積：0.02mL； T---反應(yīng)時間，30min=0.5h； W---樣本鮮重，g； 500---細胞數(shù)量，百萬； 標(biāo)準品亞*酸鈉的分子量---69； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準品母液：用 1mL 的蒸餾水溶解，再用蒸餾水稀釋 200 倍即為 0.5μmol/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。（母 液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準品：0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5μmol/mL。也可根據(jù)實際樣本來調(diào)整標(biāo) 準品濃度。 3 按照測定管的加樣步驟操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準曲線。