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谷丙/丙an酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)試劑盒

谷丙/丙an酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 谷丙轉(zhuǎn)氨酶/丙*酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)試劑盒說明書 （貨號：WS3240F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 丙*酸氨基轉(zhuǎn)氨酶，舊稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，縮寫為 ALT 或 GPT（EC 2.6.1.2）廣泛存在于 動植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化氨基酸和酮酸轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，在氨基酸代謝中具有重要 作用。 谷丙轉(zhuǎn)氨酶/丙*酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)催化丙*酸和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)， 生成丙酮酸和谷*酸；加入 2,4-二硝基*肼溶液，不僅終止上述反應(yīng)，而且與丙酮酸反應(yīng) 形成丙酮酸二硝基*腙，在堿性溶液中顯棕紅色。通過在 520nm 讀取吸光值并計(jì)算出該 酶活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 5mL×1 支 4℃保存 試劑二 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、 可調(diào)式移液器、研缽。 四、谷丙轉(zhuǎn)氨酶/丙*酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例提取。 2 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例提取。 ③ 血清（漿）樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)測定： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 520nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 可先做 2 個樣本預(yù)測定，熟悉操作過程，并依據(jù)測出的吸光值 A 是否超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的 線性范圍來做調(diào)整。 3 在 1.5mLEP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20本試劑盒僅供科研使用 2 試劑一 10 10 試劑二 60 60 混勻，于 37℃孵育 30min 試劑三 60 60 樣本 20 混勻，于 37℃孵育 10min 試劑四 600 600 混勻，25℃孵育 10min，全部液體轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿 中，于 520nm 處測定吸光值 A， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。 【注】1.若 A 測定超過 1.5，可降低樣本量 V1（如 10μL），試劑一相應(yīng)增加。則改變后的加樣 體積 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2.若△A 的值在零附近徘徊，則可增加樣本量 V1（如 30μL，則試劑一相應(yīng)減少），或增加 樣本取樣質(zhì)量（W），則改變后的加樣體積 V1 和取樣質(zhì)量 W 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0232x + 0.0022，x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（nmol）；y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GPT/ALT(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232]÷(V1×Cpr)÷T=71.8×(ΔA-0.0022)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GPT/ALT(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232]÷(W×V1÷V)÷T=71.8×(ΔA-0.0022)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GPT/ALT(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232]÷(500×V1÷V)÷T=0.144×(ΔA-0.0022) 5、血清（漿）活力計(jì)算: 酶活定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GPT/ALT(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0022)÷0.0232] ÷V1÷T=71.8×(ΔA-0.0022) V---提取液體積，1 mL； V1---反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30 min； W---樣本質(zhì)量，g；500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（20μmol/mL）：加 1mL 蒸餾水溶解標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻。 2 把母液稀釋成以下濃度：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根據(jù)實(shí)際來調(diào)整濃度。 3 30μL 標(biāo)準(zhǔn)品+60μL 試劑二+60μL 試劑三，混勻，于 37℃孵育 10min ；再加 600μL 試劑四，混勻，25℃孵育 10min，于 520nm 處測定吸光值 A，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。