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支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)活性測定試劑盒

支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)活性測定試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(Branched-chain amino acid aminotransferase，BCAT) 試劑盒說明書 (貨號：WS3440F 分光法 24 樣) 一、產(chǎn)品簡介： 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT, E.C.2.6.1.42) 屬于以磷酸吡哆醛作為輔酶的Ⅳ類轉(zhuǎn)氨酶。該酶分布十分廣 泛，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)廣泛存在于原核生物和大多數(shù)真核生物中。 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)催化特異 L-型氨基酸氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸，形成相應(yīng)的支鏈α-酮酸和谷*酸；再用特異作用于谷*酸的酶復(fù)合體分解谷*酸，同時與顯色劑反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，該物質(zhì)在 450nm 處 有吸收峰，進(jìn)而得到支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)的酶活性大小。 該酶催化反應(yīng)：L-leucine + 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 55mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 2.2mL 的蒸餾水充分溶解，仍 4℃保存。 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 1.2mL 蒸餾水溶解備用。仍 4℃保存。 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。仍 4℃保存。 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 4mL×1 支 4℃保存 試劑六 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。仍-20℃保存。 試劑七 液體 1mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 液體 mL×1 支 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽和蒸餾水。 四、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(BCAT)活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分多的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴 勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】:若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞 加入 1mL 提取液；超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，300W，超聲 3s，間隔 7s，總時間 3min）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】:若增加樣本量，按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 450nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 40 40本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 40 試劑三 20 20 試劑四 200 240 樣本 150 150 混勻，37℃反應(yīng) 60min（準(zhǔn)確時間），立即于 95℃沸水中水浴 2min 后，上下振動幾下混勻后，12000rpm 室溫離心 5 分鐘，上清液待測。 ③ 顯色反應(yīng)：在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 提取液 370 370 試劑五 80 80 試劑六 20 20 試劑七 20 20 上清液 210 210 混勻，30℃反應(yīng) 15min，液體全部轉(zhuǎn)移至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm） 中，立即于 450nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測定-A 對照（每個樣本 需設(shè)一個自身對照）。 【注】若△A 差值在零附近徘徊，可以在顯色反應(yīng)階段增加上清液（V3）的量（如增加到 300μL，則 提取液相應(yīng)減少），則改變后的 V3 重新代入公式計算；或延長第②歩中 30℃反應(yīng)時間 T（如 由 60min 增加至 90min），則改變后的反應(yīng)時間 T 需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0.0446x + 0.008； x 為谷氨*摩爾質(zhì)量（nmol），y 為△A。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每小時生成 1 nmol 的谷氨*定義為一個酶活力單位。 BCAT (nmol/h/mg prot)=[(ΔA-0.008)÷0.0446]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=320.3×(ΔA-0.008)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每小時生成 1 nmol 的谷*酸定義為一個酶活力單位。 BCAT (nmol/h/g 鮮重)=[(ΔA-0.008)÷0.0446]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T=320.3×(ΔA-0.008)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算： 單位定義：每百萬細(xì)菌或細(xì)胞每小時生成 1 nmol 的谷*酸定義為一個酶活力單位。 BCAT(nmol/h/104 cell)=[(ΔA-0.008)÷0.0446]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.64×(ΔA-0.008) V--提取液體積，1 mL；V1--加入樣本體積，0.15mL；V2--反應(yīng)總體積，0.45mL； V3--顯色階段上清液體積，0.21mL；T--反應(yīng)時間，60min=1h；W--樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量，百萬； Cpr--樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司 BCA 蛋白含量測定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 標(biāo)準(zhǔn)品母液（10nmol/μL）。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1. nmol/μL。也可根據(jù)實際樣本來 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段，測定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。