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糖原合成酶(GCS)試劑盒,微板法

糖原合成酶(GCS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 糖原合酶（Glycogen synthase，GCS）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS2650W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 糖原合酶（GCS，EC 2.4.1.11）將 UDP-G 糖基加到葡萄糖殘基上，以α-1，4-糖苷鍵相 連延長(zhǎng)糖鏈，GCS 是糖原合成的限速酶，對(duì)糖代謝和血糖穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用。 GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的逐一作用 下，使NADH氧化為NAD+，通過(guò)檢測(cè)NADH在340nm處的下降量來(lái)計(jì)算GCS酶活大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 每支用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 0.3mL 的蒸餾水溶解備用。用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑三 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、糖原合酶（GCS）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測(cè)樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，設(shè)置溫度 30℃,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 ② 試劑放在 30℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 10 試劑四 140 混勻，30℃下孵育 5min。 試劑五 10 混勻，30℃下，2min 時(shí)于 340nm 處讀取吸光 值 A1，22min 時(shí)讀取 A2，△A=A1-A2。 【注】：1.若ΔA 過(guò)小，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（如：32min 或更長(zhǎng)）再讀取 A2，或增加樣本加樣量 V1（如 增至 40μL，則試劑四相應(yīng)減小），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2.若 A2 值小于 0.45，則需縮短反應(yīng)時(shí)間 T（如減至 12min）再讀取 A2 或減少樣本量 V1（如減 至 10μL，則試劑四相應(yīng)增加），重新調(diào)整的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算 單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=160.8×ΔA÷W 3、按細(xì)胞密度計(jì)算 單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 GCS（nmol/min/104 cell）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.323×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； T---反應(yīng)時(shí)間，20 min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。