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植物果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FBA)試劑盒

植物果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(FBA)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 植物果糖1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA） 試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS3060F 紫外分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 植物中的果糖 1,6- 二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 是卡爾文循 環(huán)(Calvin)中重要的酶，是控制光合作用速率的重要酶之一。在植物中有兩種在結(jié)構(gòu)上有 一定同源性的果糖 1, 6-二磷酸醛縮酶的異構(gòu)型，即葉綠體型和胞質(zhì)型。 FBA 可催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在酶促?gòu)?fù)合物的相繼 作用下催化 NADH 和磷酸二羥丙酮生成 NAD 和α-磷酸甘油，檢測(cè) 340nm 處 NADH 的下 降速率即可得出 FBA 活性的高低。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液一 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 提取液二 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 2.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，每支加 0.6mL 蒸餾水溶解，用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。。 試劑三 液體μL×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 2.2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑四 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，再加 4.2mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、可調(diào)式移液器、天平、震蕩儀、低 溫離心機(jī)、研缽。 四、植物果糖 1,6-二磷酸醛縮酶（FBA）活性測(cè)定： 1、樣本制備： ① 總FBA酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液二進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，13000rpm 離心5min，取上清液測(cè)定。 ② 胞漿和葉綠體 FBA 酶的分離： 稱取約0.2g樣本，加入1mL提取液一，快速冰浴勻漿后于4℃，1600rpm離心5min，棄沉淀， 取上清再4℃，5000rpm離心15min，取上清用于測(cè)定胞漿FBA酶活性，取沉淀加1mL提取液 二，強(qiáng)力渦旋震蕩15s，置于冰上(或冰箱)孵育15min，在4℃，13000rpm離心5min，取上清 測(cè)定葉綠體中FBA酶活性。提示：整個(gè)葉綠體的提取過程須保持4℃低溫環(huán)境。 建議測(cè)定總 FBA 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 FBA，則按照步驟②提取粗酶液。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 2、 上機(jī)檢測(cè)： 1 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，設(shè)定溫度 25℃，蒸餾水調(diào)零。本試劑盒僅供科研使用 2 2 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 1mL 石英比色皿（光徑 1cm）中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 50 試劑一 40 試劑二 40 試劑三 40 試劑四 480 試劑五 80 輕輕混勻，室溫（25℃）條件下，于 340nm 處測(cè) 定，2min 時(shí)讀取 A1，15min 后讀取 A2， ΔA=A1-A2。 【注】1.若△A 值在零附近，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如由 15min 增至 25min 后讀取 A2），或增 加樣本加樣體積 V1（如由 50μL 增至 100μL，則試劑四相應(yīng)減少），則改變后的 T 和 V1 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 30S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來參與 計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若起始值 A1 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對(duì)會(huì) 偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測(cè)樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液用于檢測(cè)。 4. 若△A 值大于 0.5，則需減少反應(yīng)時(shí)間（如由 15min 減至 5min 后讀取 A2），或減少樣 本量（如由 50μL 減至 20μL，則試劑四相應(yīng)增加），則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 和樣本量 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 FBA(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=156.5×ΔA÷Cpr 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 FBA(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=156.5×ΔA÷W ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光徑，1cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.05mL； V2---反應(yīng)體系總體積，0.73mL=7.3×10-4L； T---反應(yīng)時(shí)間，15 min； W---樣本質(zhì)量，g Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。