樣品實(shí)驗方案

簡要概述

1. 準(zhǔn)備樣品

2. 將75 µL /孔的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品添加到抗cAMP的96孔板中

3. 在室溫下孵育5-10分鐘

4. 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶聯(lián)物

5. 在室溫下孵育3小時

6. 用200 µL /孔的洗滌緩沖液洗滌4次

7. 添加100 µL /孔的Amplite Green

8. 在室溫下孵育1至3個小時

9. 檢測405、650或740 nm處的吸光度增加

溶液配制

儲備溶液配制

1. cAMP儲備溶液（100 µM）：將1 mL測定緩沖液（組分B）添加到cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（組分A）的小瓶中。

2. HRP-cAMP共軛原液（50X）：將55 µL（#36370）或550 µL（#36371）的測定緩沖液（組分B）添加到HRP-cAMP偶聯(lián)物（組分C）的小瓶中。 注意：未使用的50X HRP-cAMP共軛原液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在-20℃下保存。

3.洗滌液（1倍）：將1 mL的10X洗滌溶液（組分D）添加到9 mL蒸餾水中。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

在分析緩沖液（組分B）中對cAMP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1：10、1：100和1：3的系列稀釋，以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀釋溶液。 存放在冰箱或4°C下。

工作溶液配制

HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液：
在使用前，用測定緩沖液（組分B）以1:50稀釋，使其具有1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意：25 µL 1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液足以用于一個測定點(diǎn)； 準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)捏w積，僅供一次性使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

實(shí)驗步驟

1.準(zhǔn)備樣品

1.1根據(jù)需要處理細(xì)胞：
以下是用Forskolin處理的Hela細(xì)胞以96孔板誘導(dǎo)cAMP的示例：吸出細(xì)胞生長培養(yǎng)基，在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes緩沖液（HHBS），在5％CO2，37°C恒溫箱，放置15分鐘。孵育后吸出細(xì)胞溶液，加入100 µL /孔的細(xì)胞裂解緩沖液（組分E），然后在室溫下另外孵育10分鐘。該細(xì)胞裂解液可以直接測定，也可以在測定緩沖液（組分B）中稀釋后測定。注意：應(yīng)單獨(dú)評估每個細(xì)胞系，以確定細(xì)胞密度。細(xì)胞可以在實(shí)驗的前或?qū)嶒灝?dāng)天接種，具體取決于細(xì)胞類型和/或受試化合物的作用。

1.2組織樣本：
由于組織中環(huán)狀核苷酸的快速代謝，重要的是在收集后快速冷凍組織（例如，使用液氮）。稱重冷凍的組織，并添加10-20 µL / mg細(xì)胞裂解緩沖液。在冰箱均質(zhì)樣品。高速旋轉(zhuǎn)5分鐘并收集上清液。上清液可以直接測定。

1.3尿液，血漿和培養(yǎng)基樣品：
尿液和血漿可以直接在1X裂解緩沖液中以1：200至1：1000的稀釋度進(jìn)行測試。也可以在裂解緩沖液中以1:10至1：200的稀釋度測試培養(yǎng)基。注意：RPMI介質(zhì)可能包含> 350 fmol / µL cAMP。

2.cAMP測定

2.1所有測定孔均按以下順序準(zhǔn)備：A）cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，對照或測試樣品； B）HRP-cAMP偶聯(lián)物。

2.2將75 µL /孔的cAMP稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液和測試樣品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（組分F）的每個孔中。 我們建議對每個標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品重復(fù)測定。在室溫下孵育5至10分鐘。

2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液。 將板放在搖床上，在室溫下孵育3小時。

2.4吸出板內(nèi)容物，并用200 µL /孔的1X洗滌液洗滌4次。

2.5在每個孔中加入100 µL /孔的Amplite Green（組分G），并在避光的情況下在室溫下孵育60分鐘至3小時。

2.6使用光吸收酶標(biāo)儀檢測在405 nm，650 nm或740 nm處的吸光度增加。