樣品實驗方案

簡要概述

1. 用5×105至1×106細(xì)胞/ mL的密度制備含測試化合物的細(xì)胞

2. 在0.5 mL細(xì)胞溶液中加入1 µL 500X MitoTell Red

3. 將細(xì)胞在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育15-30分鐘

4. 沉淀細(xì)胞，然后將細(xì)胞重懸于0.5 mL檢測緩沖液中

5. 使用帶有APC或Cy5通道的流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞

實驗步驟

1.對于每個樣品，在0.5 mL溫暖的培養(yǎng)基或自備的緩沖液中以5×105至1×106細(xì)胞/ mL的密度制備細(xì)胞。注意：應(yīng)單獨評估每種細(xì)胞系，以確定誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞密度。

2.用測試化合物處理細(xì)胞一段時間，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并建立平行對照實驗。注意：我們在37oC下用20µM CCCP處理Jurkat細(xì)胞15分鐘，以改變線粒體膜電位。CCCP或FCCP可以與MitoTell Red同時添加。為了獲得結(jié)果，可能需要為每個單獨的細(xì)胞系滴定CCCP或FCCP。

3.向處理過的細(xì)胞中加入1 µL 500X MitoTell Red（組分A）。

4.將細(xì)胞在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育15至30分鐘。注意：對于貼壁細(xì)胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在與MitoTell Red孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。

5.以800 rpm的速度離心細(xì)胞4分鐘，然后將細(xì)胞重懸于0.5 mL的測定緩沖液（組分B）或自備的緩沖液中。

6.使用流式細(xì)胞儀通過APC或Cy5通道檢測熒光強度。