樣品實驗方案

簡要概述

1. 用測試化合物制備細胞（200 µL /樣品）

2. 添加膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647測定溶液

3. 在室溫下孵育30-60分鐘

4. 使用帶有660/20 nm濾光片（APC通道）的流式細胞儀或帶有Cy5濾光片組的熒光顯微鏡分析細胞

實驗步驟

1.用膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647制備和孵育細胞：

1.1用測試化合物處理細胞一段時間（對于用星形孢菌素處理過的Jurkat細胞，需要4-6小時）以誘導細胞凋亡。

1.2離心細胞以獲得1-5×105細胞/管。

1.3將細胞重懸于200 µL分析緩沖液（組分B）中。

1.4向細胞中加入2 µL Annexin V-iFluor 647（組分A）。

1.5避光保存，于室溫下孵育30至60分鐘。

1.6在使用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，添加300 µL分析緩沖液（組分B）以增加體積。

1.7使用帶有660/20 nm濾光片的流式細胞儀（APC通道）或帶有Cy5濾光片組的熒光顯微鏡檢測熒光強度。

2.通過使用流式細胞儀進行分析：

2.1使用帶有660/20 nm濾光片（APC通道）的流式細胞儀定量膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647的結(jié)合物。

3.通過使用熒光顯微鏡進行分析：

3.1孵育后用移液管吸移細胞，用測定緩沖液沖洗1-2次，然后用測定緩沖液重懸細胞。

3.2將細胞添加到載玻片蓋玻片的載玻片上。 注意：對于貼壁細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與Annexin V-iFluor 647一起孵育后，用測定緩沖液沖洗1-2次，然后將測定緩沖液加回到蓋玻片上。 將玻片上的蓋玻片倒置并可視化細胞。 與膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647孵育后，還可以將細胞固定在2％甲醛中，并在顯微鏡下觀察。

3.3使用Cy5濾光片組，在熒光顯微鏡下用Annexin V-iFluor 647分析凋亡細胞。當?shù)饣V添加到細胞中時，通過使用TRITC通道測量細胞活力。質(zhì)膜上的橙色染色表明膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647與細胞表面的PS結(jié)合。