簡要概述

1. 用測試化合物進行細胞準備工作

2. 去掉培養(yǎng)基

3. 加入CytoCalcein™Red AM工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）

4. 室溫下孵育30min-1h

5. 監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）的熒光強度（底部讀取模式）

儲備溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復凍融循環(huán)。
1. CytoCalcein™Red AM儲備溶液：
向CytoCalcein™Red AM小瓶（組分A）中加入20 µL DMSO（組分B），并充分混合以制成CytoCalcein™Red AM儲備液。 注意：20 µL CytoCalcein™Red AM儲備液足以裝滿一塊板。 避光。 為了存放，請將管子緊緊密封。 注意：如果試管密封嚴密，可將未使用的CytoCalcein™Red儲備液分裝并在<-20℃下保存1個月。 避免重復凍融循環(huán)。

工作溶液配制
將全部內(nèi)容物（20 µL）的CytoCalcein™Red AM儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分C）中，并充分混合以制成CytoCalcein™Red AM工作溶液。 注意：此CytoCalcein™Red AM工作溶液不穩(wěn)定，請立即使用。 注意：如果這些細胞（例如CHO細胞）含有會導致熒光染料隨時間泄漏的有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，則應準備丙*舒儲備溶液并以孔內(nèi)工作濃度1加入到緩沖液中 -2.5毫米 分裝并保存未使用的丙*舒儲備溶液于≤-20 ℃。

操作步驟

1. 根據(jù)需要用測試化合物處理細胞。 注意：添加化合物之前不必洗滌細胞。 但是，如果測試的化合物對血清敏感，則可以在添加化合物之前將生長培養(yǎng)基和血清因子吸掉。 加入100 µL /孔（96孔板）和25 µL /孔（384孔板）的1X Hank鹽溶液和20 mM Hepes緩沖液（HHBS）或抽吸后選擇的緩沖液。 或者，細胞可以在無血清培養(yǎng)基中生長。

2. 去除生長培養(yǎng)基

3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的CytoCalcein™Red AM工作溶液。

4. 在避光的條件下，在室溫或37°C下孵育板30分鐘至1小時。 注意：適當?shù)姆跤龝r間取決于所用的單個細胞類型和細胞濃度。 優(yōu)化每個實驗的孵育時間。 對于非貼壁細胞，建議在孵育后以800 rpm的速度離心細胞板2分鐘。

5. 使用熒光酶標儀（底部讀取模式）在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）下監(jiān)控熒光強度。