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Ex?(nm)	468	Em?(nm)	493
分子量	793.99	溶劑	DMSO
存儲(chǔ)條件	在零下15度以下保存,?避免光照

產(chǎn)品參數(shù)

Ex (nm)	468	Em (nm)	493
分子量	793.99	溶劑	DMSO
存儲(chǔ)條件	在零下15度以下保存, 避免光照

產(chǎn)品概述

AAT Bioquest的iFluor 460琥珀酰亞胺酯染料 針對(duì)標(biāo)記蛋白質(zhì)（特別是抗體）進(jìn)行了優(yōu)化。這些染料是明亮的，耐光的，并且對(duì)蛋白質(zhì)的淬滅作用小。盡管在許多新型熒光儀器中都安裝了460 nm藍(lán)光二極管激光器，但很少有染料可以在460 nm處被很好地激發(fā)。iFluor 460經(jīng)過優(yōu)化，可以被460 nm的藍(lán)光二極管激光器很好地激發(fā)，從而為配備460 nm藍(lán)光二極管激光器的新型熒光儀器實(shí)現(xiàn)了新的生物學(xué)應(yīng)用。iFluor 460 SE相當(dāng)穩(wěn)定，并且對(duì)蛋白質(zhì)氨基具有良好的反應(yīng)性和選擇性。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的iFluor 460琥珀酰亞胺酯染料 。

實(shí)驗(yàn)方案

樣品分析方案

儲(chǔ)備溶液配制

1.蛋白質(zhì)儲(chǔ)備液（溶液A）

將100 µL反應(yīng)緩沖液（例如1 M碳酸鈉溶液或pH值為9.0的1 M磷酸鹽緩沖液）與900 µL目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，如果可能，蛋白濃度> 2 mg / mL）混合，得到1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備液。
注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH值低于8.0，請(qǐng)使用1 M碳suan氫鈉溶液或1 M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH值調(diào)整為8.0-9.0。
注意：蛋白質(zhì)應(yīng)溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果將蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘安酸緩沖液中，則必須使用pH 7.2-7.4的1X PBS進(jìn)行透析，以去除用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，結(jié)合效率會(huì)大大降低。為了獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.染料原液（溶液B）
將無水DMSO加入iFluor™460 SE小瓶中，制成10-20 mM儲(chǔ)備液。通過輕柔移液或渦旋混合均勻。
注意：開始綴合之前，請(qǐng)準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）立即使用。染料儲(chǔ)備溶液的長時(shí)間儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性，避免凍融循環(huán)。
注意：收到后，iFluor™染料應(yīng)儲(chǔ)存在<-15°C的環(huán)境中，并遠(yuǎn)離光線和濕氣。
注意：重新配制的iFluor™染料SE的DMSO儲(chǔ)備溶液可以在<-15°C下保存長達(dá)4周。
注意：所需的蛋白質(zhì)綴合物應(yīng)在載體蛋白質(zhì)（例如0.1％牛血清白蛋白）存在的情況下以> 0.5 mg / mL的濃度保存。當(dāng)在2 mM疊d化鈉存在下存儲(chǔ)時(shí)，綴合物溶液可以在4°C下存儲(chǔ)兩個(gè)月而無明顯變化。為了更長的存儲(chǔ)時(shí)間，可以將蛋白綴合物凍干或分成單份使用，并保存在≤-60°C下，并避光。

操作步驟

該標(biāo)記方案是針對(duì)山羊抗小鼠IgG與iFluor™460 SE的綴合物而開發(fā)的，供參考。您的實(shí)際情況可能需要進(jìn)一步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。

確定的染料/蛋白質(zhì)比率（可選）

每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比率，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記可能會(huì)不利地影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。我們建議您使用一系列不同量的標(biāo)記染料溶液，通過實(shí)驗(yàn)確定的染料/蛋白質(zhì)比率。通常，大多數(shù)染料-蛋白質(zhì)綴合物推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。

以溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的10：1摩爾比為起點(diǎn)：將5 µL染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假定染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）添加到蛋白質(zhì)瓶中。溶液（95 µL溶液A）有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10 mg / mL，蛋白質(zhì)的分子量為?200KD，則蛋白質(zhì)的濃度約為0.05 mM。
注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)小于10％。
進(jìn)行綴合反應(yīng)。
重復(fù)步驟2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1；15：1和20：1。
使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。
計(jì)算上述4種綴合物的染料/蛋白質(zhì)比率（DOS）。
對(duì)以上4種綴合物進(jìn)行檢測(cè)，以確定的染料/蛋白質(zhì)比率，以擴(kuò)大標(biāo)記反應(yīng)的范圍。

進(jìn)行綴合反應(yīng)

在有效搖動(dòng)下，將適量的染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）添加到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中。
注意：溶液B /溶液的摩爾比由上述步驟確定。如果跳過該步驟（本節(jié)：確定的染料/蛋白質(zhì)比），我們建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比為10：1。
在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

純化

以下方案是使用Sephadex G-25色譜柱純化染料-蛋白質(zhì)綴合物的示例。

準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。
將反應(yīng)混合物（步驟的一步：進(jìn)行綴合反應(yīng)后的混合物）加載到Sephadex G-25色譜柱的頂部。
樣品剛好在頂部表面下方流動(dòng)時(shí)，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。
向所需樣品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4），以完成柱純化。
注意：為了立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝多次使用。
注意：為了長期保存，染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物溶液需要濃縮或冷凍干燥（見下文）。