1. 原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的孔雀石綠結(jié)晶紫和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)孔雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠結(jié)晶紫的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)孔雀石綠結(jié)晶紫的含量。
2. 試劑盒組成
(1) 酶標(biāo)板： 96 T/8孔
(2) 標(biāo)準(zhǔn)品液:(1.0 mL/瓶)0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb。
(3) 酶標(biāo)記物： 1瓶(12 mL)。
(4) 抗體工作液： 1瓶(7 mL)。
(5) 底物緩沖液： 1瓶(7 mL)。
(6) 底物液： 1瓶(7 mL)。
(7) 終止液： 1瓶(7 mL)。
(8) 20倍濃縮洗液：1瓶(50 mL)加蒸餾水稀釋到1000 mL。
(9) 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品液：(0.2 mL)。
(10) 提取液A (50 mL)
(11) 提取液B (50 mL)
3. 需要但試劑盒中不提供的器材和試劑
(1)設(shè)備
…微孔板酶標(biāo)儀(450 nm)
…均質(zhì)器
…振蕩器
…離心機(jī)
…各種量程的微量移液器
(2)試劑
…蒸餾水
…環(huán)已烷
5. 儲(chǔ)存條件
(1) 2-8 ℃保存，切勿冷凍。
(2) 將不用的酶標(biāo)板放進(jìn)原袋中重新密封。
(3) 酶標(biāo)記物和顯色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
6. 樣品處理
(1) 魚/蝦樣品的準(zhǔn)備(稀釋倍數(shù)10)
先將魚肉勻質(zhì)后，稱取0.5 g樣品，加入500 μL的0.125 mol/L(Ph4.5)乙酸緩沖液，200ul的0.25g/mL鹽酸羥胺，300ul的0.05mol/L對(duì)甲苯磺酸，震蕩15分鐘使之成勻漿，12000rpm離心5min，然后取上清用PBST稀釋5倍，用作ELISA檢測(cè)
(2) 水質(zhì)樣品(稀釋倍數(shù)1)離心后取50µl作ELISA分析。
7. 免疫分析時(shí)試劑的準(zhǔn)備
(1)注意事項(xiàng)
A)使用之前將所有試劑平衡至室溫。
B)使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
C)在使用中不要讓微孔干燥。
D)EIA分析的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的*性，仔細(xì)按照*的洗板順序操作是EIA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
E)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
(2)濃縮洗滌液使用前應(yīng)根據(jù)所需量進(jìn)行20倍稀釋，即按1mL濃縮洗滌液加入19mL蒸餾水的比例進(jìn)行稀釋。
8. 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制方法：
(1)用稀釋好的洗液將1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品液稀釋1000倍，變成1000ng/mL，振蕩混勻。
(2)準(zhǔn)備5個(gè)1 mL瓶子，其中一個(gè)加入1000 μL洗液，其余的分別加入600 μL洗液。
(3)在1000 μL洗液瓶子中先吸出4.05 μL的洗液，然后加入4.05 μL的1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，
混勻，使其濃度為4.05 ng/mL，作好記號(hào)；
(4)再?gòu)?.05ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個(gè)600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為1.35 ng/mL，混勻，作好記號(hào)；
(5)再?gòu)?.35 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個(gè)600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.45 ng/mL，混勻，作好記號(hào)；
(6)再?gòu)?.45 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個(gè)600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.15 ng/mL，混勻，作好記號(hào)；
(7)再?gòu)?.15ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個(gè)600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.05 ng/mL，混勻，作好記號(hào)。
9. 測(cè)定程序
(1)將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所需微量反應(yīng)板(均需2個(gè)平行試驗(yàn))放在反應(yīng)架上。
(2)加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)液或處理好的樣品到各自的微孔板中。
(3)加入50μl已稀釋的抗體應(yīng)用液加入微量反應(yīng)板，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應(yīng)20分鐘。
(4)棄去孔中液體，并將微孔板剩余殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
(5)加入100μl酶標(biāo)記物應(yīng)用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后， 室溫下反應(yīng)15分鐘。
(6)棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
(7)加底物緩沖液50μl，再加入底物液50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，在室溫避光處孵育10分鐘。
(8)加入50μl終止液到微孔板中，混合好在450nm處測(cè)量吸光度值，在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。
10. 結(jié)果
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實(shí)際濃度。
11. 測(cè)定技術(shù)指標(biāo)
(1) 靈敏度：
孔雀石綠檢測(cè)試劑盒的平均檢測(cè)下限約為0.01ng/g(0.01ppb)。
(2) 準(zhǔn)確度(回收率)：回收率為90%±15%。
12. 交叉反應(yīng)活性
孔雀石綠檢測(cè)試劑盒能檢測(cè)孔雀石綠及其相似物，它們的結(jié)合程度不同。以下表格中展示的是相關(guān)值及交叉反映率(%CR)，所有濃度均為ppb級(jí)。
| 種類 | % CR |
| 孔雀石綠 | * |
| 隱性孔雀石綠 | <10% |
| 結(jié)晶紫 | * |
| 隱性結(jié)晶紫 | <10% |
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