醫(yī)療污水處理設(shè)備實(shí)驗(yàn)流程：
1 材料與方法
1.1 樣品采集
本實(shí)驗(yàn)樣品取自江蘇某醫(yī)藥化工園區(qū)廢水處理廠, 該廢水廠主要功能是處理園區(qū)各醫(yī)藥化工企業(yè)排放的工業(yè)廢水, 納入廢水廠管網(wǎng)的廢水包括抗生素中間體廢水及nong藥中間體廢水等多種醫(yī)藥化工廢水.該廢水廠日處理量10萬(wàn)t, 收集的廢水中含β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類等幾大類抗生素生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的高濃發(fā)酵廢水、化學(xué)合成廢水、其他制劑廢水及混合廢水(清洗水、冷卻循環(huán)水和生活污水等).廢水中含大量殘留的抗生素原材料、副反應(yīng)產(chǎn)物, 還含有機(jī)溶劑二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、四qing呋喃和二氯甲烷等.廢水廠主要采用厭氧-缺氧-好氧(A2O)工藝.本實(shí)驗(yàn)樣品為活性污泥, 具體取自*混合式好氧生物處理池.取樣時(shí)先在池內(nèi)前中后三段各取約500 mL泥水混合樣品, 以保證樣品具有代表性, 現(xiàn)場(chǎng)混合均勻后, 用無(wú)菌50 mL離心管分裝后冰袋低溫冷藏, 當(dāng)日即進(jìn)行基因組DNA提取.
1.2 基因組DNA提取
使用FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, CA, USA)試劑盒根據(jù)產(chǎn)品操作手冊(cè)提取樣品基因組DNA.采用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量和完整性.用NanoDropTM 2 000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)和Qubit® 2.0熒光光譜儀(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)檢測(cè)DNA的產(chǎn)量和純度.基因組DNA樣品用干冰保藏并立即送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.
醫(yī)療污水處理設(shè)備實(shí)驗(yàn)流程：
1.3 ARGs生物信息學(xué)分析
采用Illumina HiSeq Xten平臺(tái)進(jìn)行PE150雙端測(cè)序.首先對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制, 去除堿基數(shù)大于40 bp但是其質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于38的序列, 去掉歧義核苷酸超過(guò)10個(gè)的序列, 去掉與adapter序列有15 bp重疊的序列.采用SOAPdenovo軟件組裝clean reads.當(dāng)選擇zui高的scaffold N50 value來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步分析時(shí), 選擇不同的K-mer值(49、55和59)用于使用于不同的-d1、-M3、-u和-F參數(shù).將得到的scaffold片段在N段打斷, 進(jìn)而得到scaftig片段.僅僅大于500 bp的scaftig片段被保留以作進(jìn)一步分析.采用默認(rèn)參數(shù)的MetaGeneMark軟件從組裝好的scaftig片段來(lái)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(ORFs), 采用CD-HIT來(lái)獲得非冗余基因.采用SOAPaligner軟件將保留的clean read與基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 以計(jì)算匹配的數(shù)目.通過(guò)去除含有少于3個(gè)mapped reads映射片段的基因類別來(lái)獲得unigene.用DIAMOND軟件將unigene與NCBI-NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 設(shè)置blastp參數(shù)e-value≤1e-5, 并且采用MEGAN軟件LCA算法進(jìn)行注釋.采用DIAMOND軟件(blastp, evalue ≤ 1e-5)將unigene對(duì)應(yīng)的蛋白序列在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)和CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì).利用BLAST軟件(blastp, evalue≤1e-5)將unigene在CARD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 進(jìn)行ARGs注釋.采用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析, 以研究ARGs與微生物分類的關(guān)系.
2 結(jié)果與討論
2.1 醫(yī)藥化工污水廠中微生物群落結(jié)構(gòu)
在該好氧活性污泥樣品中, 經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后, 共得到reads數(shù)目109 523 076條, 并由此組裝得到55 255個(gè)scaftig, 并預(yù)測(cè)了105 892個(gè)unigene.利用DIAMOND軟件將unigene在NCBI-NR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì), 后續(xù)用MEGAN軟件進(jìn)行注釋, 統(tǒng)計(jì)樣本在門(mén)水平(表 1)及屬水平(圖 1)上的*個(gè)豐度zui大的群落組成.
