所有G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）在通過配體結(jié)合后，都會通過一條共同途徑迅速發(fā)生脫敏作用。 β-arrestin（一種細(xì)胞質(zhì)蛋白）與受體的結(jié)合使GPCR信號失活，并啟動了受體向細(xì)胞內(nèi)的易位，在此細(xì)胞中配體被去除，受體被循環(huán)回到細(xì)胞膜。通過將熒光標(biāo)記（例如GFP）附著到β-arrestin，可以檢測受體arrestin復(fù)合物的位置。由于脫敏僅發(fā)生在受體上，因此檢測β-arrestin的易位和隨后的受體再循環(huán)提供了檢測GPCR靶標(biāo)可靠方法。蛋白質(zhì)易位GPCR信號檢測試劑盒提供了功能強(qiáng)大的功能分析，可通過熒光成像篩選目標(biāo)化合物針對已知或孤立GPCR靶標(biāo)的活性。靶向GPCR的誘導(dǎo)熒光向細(xì)胞膜和內(nèi)吞囊泡的移位。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)易位GPCR信號檢測試劑盒。
適用儀器
| 熒光顯微鏡 | |
| Ex: | FITC濾波片組 |
| Em： | FITC濾波片組 |
| 推薦孔板: | 黑色透明底板 |
樣品實(shí)驗方案
概述
準(zhǔn)備細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染
準(zhǔn)備Transfectamine 5000-DNA混合物
將Transfectamine 5000-DNA混合物添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，并孵育過夜
轉(zhuǎn)染后24-30小時將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板中，并將培養(yǎng)物孵育過夜
在熒光顯微鏡下分析由GPCR引起的轉(zhuǎn)運(yùn)
細(xì)胞準(zhǔn)備
細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時它們將達(dá)到約60-70％的融合度。
轉(zhuǎn)染前用新鮮的生長培養(yǎng)基替換。
注意：例如，對于6孔板，每孔替換為2 mL培養(yǎng)基，對于10 cm板，則替換為6 mL培養(yǎng)基。
儲備溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
β-arrestin-GFPDNA儲備溶液
向小瓶β-arrestin-GFPDNA（組分A）中加入10 µL ddH2O，充分混合至終濃度為1 µg / µL。
操作步驟
1.將3 µg DNA（例如1.5 µg Beta-arrestin-GFP DNA儲備液和1.5 µg您準(zhǔn)備的GPCR DNA）與200 µL無血清培養(yǎng)基混合。
2.向混合物中加入9 µL Transfectamine 5000（組分B）。
3.充分混合并在室溫下孵育20分鐘。
注意：Transfectamine 5000和DNA的比例需要針對不同的細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化，通常，在我們的測試中，Transfectamine 5000轉(zhuǎn)染試劑（µL）與DNA（µg）的比例應(yīng)為3-5 µL：1ug。
表1. 6孔板和10 cm板的樣本表
| 6孔板（每孔） | 10cm板 | |
| 新鮮培養(yǎng)基 | 2 mL | 6 mL |
| 質(zhì)粒 | 3 µg | 10 µg |
| 無血清培養(yǎng)基 | 200 µL | 600 µL |
| Transfectamine 5000轉(zhuǎn)染試劑 | ~9 µL | ~30 µL |
轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)運(yùn)方案
1.將Transfectamine 5000 -DNA混合物添加到培養(yǎng)板中，并孵育過夜。
注意事項：在轉(zhuǎn)染后16小時即可檢測到重組蛋白。轉(zhuǎn)染后72?96小時可觀察到大表達(dá)水平。
2.轉(zhuǎn)染后24-30小時將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板中，并孵育過夜。
使用FITC濾光片（Ex / Em = 488/530 nm）在熒光顯微鏡下檢測受體誘導(dǎo)的β-arrestin易位。
