脂多糖( LPS ),也稱(chēng)為內(nèi)毒素,是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分。LPS是脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的強(qiáng)力刺激劑,可引起發(fā)燒、感染性休克、死亡。它也被認(rèn)為是檢測(cè)細(xì)菌病原體入侵的生物標(biāo)志物,負(fù)責(zé)炎癥反應(yīng)和內(nèi)毒素休克的發(fā)展。在生物材料,如蛋白質(zhì)、多肽或抗體樣品中檢測(cè)LPS是生物制造和生物加工的一項(xiàng)重要任務(wù)。Portelite 快速熒光法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒使用Endotoxin Green,一種敏感的熒光底物。Endotoxin Green可以在內(nèi)毒素和鱟血細(xì)胞提取物鱟素( LAL )的存在下水解,產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。內(nèi)毒素活性與Endotoxin Green水解產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度成正比。Portelite 快速熒光法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒針對(duì)Cytocite™和Qubit™熒光儀進(jìn)行了優(yōu)化,可以檢測(cè)樣品中廣泛存在的內(nèi)毒素(從1 EU / ml到0.002 EU / ml)。
適用儀器
CytoCite熒光計(jì) | |
Ex: | 480nm |
Em: | 510-580nm |
耗材推薦: | 0.2 mL, 薄壁PCR管 |
樣品分析方案
概述
制備細(xì)胞裂解液(LAL)工作溶液
添加大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品(50µL)
添加LAL工作溶液(50µL)
在37°C下孵育30分鐘
準(zhǔn)備并添加Endotoxin Green工作溶液(100µL)
用CytoCite監(jiān)測(cè)熒光
溶液配制
儲(chǔ)備溶液配制
1.Endotoxin Green儲(chǔ)備液
對(duì)于試劑盒#60008,將50µL DMSO加入一小瓶Endotoxin Green中 (組分A)制備內(nèi)毒素底物儲(chǔ)備溶液。對(duì)于試劑盒#60009,將500µL DMSO加入一小瓶Endotoxin Green中 (組分A)制備內(nèi)毒素底物儲(chǔ)備溶液。 注意避光。
2.LAL細(xì)胞裂解液儲(chǔ)備液
對(duì)于試劑盒#60008,將500µL無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)添加到LAL試劑瓶(組分C)中,制成5倍LAL儲(chǔ)備溶液。對(duì)于試劑盒#60009,將2.5 mL無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)添加到LAL試劑瓶(組分C)中,制成5倍LAL儲(chǔ)備溶液。
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
E、 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液
將10µL 100 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到990µL無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)中,生成1 EU/mL的大腸桿菌內(nèi)毒素溶液。然后取1 EU/mL大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,在無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)中進(jìn)行1:3的連續(xù)稀釋?zhuān)垣@得連續(xù)稀釋的大腸桿菌內(nèi)毒素1至0.001 EU/mL。
工作溶液配制
1. Endotoxin Green工作溶液
對(duì)于試劑盒#60008,添加50µLEndotoxin Green 將儲(chǔ)備溶液溶于5mL無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)中,使總體積為5.05mL Endotoxin Green工作溶液。對(duì)于試劑盒#60009,添加500µLEndotoxin Green 將儲(chǔ)備溶液溶于50mL無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)中,使總體積為50.5mLEndotoxin Green工作溶液。 注:每次測(cè)試需要100µL,請(qǐng)將工作溶液避光,將未使用的儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在-20°C。
2. LAL工作溶液
對(duì)于試劑盒#60008,將500µL LAL細(xì)胞裂解液儲(chǔ)備溶液添加到2 mL無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)中,使總體積為2.5 mL LAL細(xì)胞裂解液(LAL)工作溶液。對(duì)于試劑盒#60009,將2.5 mL LAL細(xì)胞裂解液(LAL)儲(chǔ)備溶液添加到10 mL無(wú)內(nèi)毒素水(組分B)中,使總體積為12.5 mL LAL裂解液工作溶液。
操作步驟
1.在0.2 mL PCR管(Cat#CCT100)中制備大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照品或測(cè)試樣品(50µL)。
2.向每管大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照品和測(cè)試樣品中加入50µL鱟紅細(xì)胞裂解液工作溶液。
3.充分混合并在37°C下孵育30分鐘。
4.添加100µLEndotoxin Green 每管內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照品和測(cè)試樣品的工作溶液,使總分析體積為200µL/孔。
5.將樣本放入CytoCite 并用綠色熒光通道監(jiān)測(cè)熒光。
注:為獲得良好結(jié)果,在添加工作溶液后2至10分鐘內(nèi)讀取。
注:可加入50µL 25%乙酸以停止反應(yīng)。