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酸性磷酸酶(ACP)試劑盒,微板法

酸性磷酸酶(ACP)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，ACP）活性測定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS3090W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 磷酸酶是一種重要的水解酶。酸性磷酸酶（ACP，EC 3.1.3.2）在酸性條件下磷酸酯去 磷酸化。本試劑盒提供一種高靈敏度，簡單，直接的檢測方法，使用磷酸對(duì)硝基苯酯（pNPP） 作為底物，生成黃色的產(chǎn)物PNP，該產(chǎn)物在405nm處有吸收峰。通過檢測PNP在405nm 下的增加速率，即可得到酸性磷酸酶（ACP）活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 支 4℃保存 每支臨用前加 1mL 試劑一混 勻，現(xiàn)配現(xiàn)用，一周內(nèi)用完。 試劑三 液體 3mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、蒸餾水。 四、酸性磷酸酶（ACP）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰 浴勻漿，4℃×12000rpm 離心 15min，取上清液待測。 【注】:①若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ②樣本制備，當(dāng)天準(zhǔn)備當(dāng)天測定。且樣本中應(yīng)避免酒石酸鹽，氟化物，EDTA，草酸鹽和檸檬 酸鹽等物質(zhì)，因其對(duì)酸性磷酸酶的活性有抑制作用。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或 細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：可直接測定，或者適當(dāng)稀釋后測定。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，設(shè)置溫度 37℃，調(diào)節(jié)波長為 405nm。 ② 所有試劑于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。 ③ 在 96 孔板中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 空白管 （只做一次） 樣本 10 試劑一 140 150 試劑二 20 20 混勻，避光反應(yīng)，37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱孵育 20min 試劑三 30 30 混勻，在 37℃下靜置 5min，立即于 405nm 下讀取吸本試劑盒僅供科研使用 2 光值 A，△A= A 測定-A 空白。 【注】：① 最后一步檢測時(shí)，若有結(jié)晶析出，需要 37℃復(fù)溶再讀取吸光值。 ② 若△A 的值非常低在零附近，可增加樣本量 V1（如增至 20μL，則試劑一相應(yīng)減少）或 延長反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 30min 或更長），則重新調(diào)整的 V1 和 T 須代入公式重新計(jì)算。 ③ 若△A 的值超過 1，則需要稀釋樣本，稀釋倍數(shù) D 代入計(jì)算公式； ④ 若樣本上清液顏色較深且偏黃色可增加樣本自身對(duì)照管消除背景色造成的影響，對(duì)照管 為：10μL 樣本+140μL 試劑一+20μL 蒸餾水，37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱孵育 20min 后，再 加 30μL 試劑三，37℃下靜置 5min 后于 405nm 讀值，△A=A 測定-A 對(duì)照。提醒：若設(shè) 定對(duì)照管，則可檢測的樣本數(shù)量會(huì)相應(yīng)減少，由 96 樣減少為 48 樣。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 51.516x - 0.0018，x 是 PNP 摩爾質(zhì)量：μmol；y 是△A。 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義:在 37℃下，每克組織每分鐘水解 1μmol PNPP 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個(gè)酶活單位。 ACP (μmol/min/g 鮮重)=[(△A+0.0018)÷51.516]÷(W×V1÷V)÷T×D =0.1×(△A+0.0018)÷W×D 3、按照樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義:在 37℃下，每毫克蛋白每分鐘水解 1μmol PNPP 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個(gè)酶活單位。 ACP(μmol/min/mg prot)=[(△A+0.0018)÷51.516]÷(Cpr×V1)÷T×D =0.1×(△A+0.0018)÷Cpr×D 4、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義:在 37℃下，每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解 1nmol PNPP 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個(gè)酶活單位。 ACP (nmol/min/104 cell)=[(△A+0.0018)÷51.516]×103÷(500×V1÷V)÷T×D =0.194×(ΔA+0.0018)×D 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義:在 37℃下，每毫升液體每分鐘水解 1μmol PNPP 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個(gè)酶活單位。 ACP 活力(μmol/min/mL)=[(△A+0.0018)÷51.516]÷V1÷T=0.1×(△A +0.0018) W---樣品質(zhì)量，g； V---提取液體積，1 mL； V1---上清液體積（mL），0.01mL； T---反應(yīng)時(shí)間，20 min。 D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； 500---細(xì)胞數(shù)量，萬； Cpr---上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸餾水超聲溶解， 若有結(jié)晶析出，需 37℃水浴至*全溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3 μmol/ml。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。