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小鼠心臟組織蛋白樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 蛋白質(zhì)雙向電泳
1) *向固相pH梯度等電聚焦電泳
a. 上樣:*向等電聚焦采用膠內(nèi)加樣的方法進(jìn)行。吸取一定量的蛋白樣品(銀染樣品的蛋白上樣量為140 ug計(jì),考染樣品為1.3 mg)加入重泡漲液(8 mol/L尿素,2%CHAPS,痕量濱酚藍(lán),20 mmol/L DTT,0.5 % IPG buffer),使終體積達(dá)到350ul。混勻后均勻加在IPG膠條holder的正、負(fù)極之間。將預(yù)制IPG膠條(pH 3 -10 NL)除去保護(hù)膜,膠面向下,覆于holder中的樣品之上;慢慢下壓膠條,并前后移動(dòng),避免生成氣泡。在膠條上方均勻封以1 ml覆蓋油,蓋上蓋子。
b. 等電聚焦:將裝有樣品和IPG膠條的strip holder置一向電泳儀(IPGphorTM Isoelectric Focusing System)上進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦參數(shù):0V電壓下泡漲3h,30V電壓下泡漲10 h,500 V電壓下電泳0.5 h,2000V電壓下電泳0.5 h,5000 V電壓下電泳0.5 h,8000 V電壓下電壓20 h。
c. 膠條的平衡:*向電泳結(jié)束后,取出IPG膠條平衡兩次,每次15 min。平衡緩沖液(50 mol/L Tris buffer pH 8.8,6 mol/L尿素,30甘油,0.8 g澳酚藍(lán),20 mmol/L DTT,含2 % (w/v) SDS)可減少電內(nèi)滲,有利于蛋白質(zhì)從*向轉(zhuǎn)移到第二向。在第二步平衡中用100mmol/L碘乙酞胺代替DTT以除去*步平衡時(shí)的DTT。平衡后的IPG膠條沿邊緣用濾紙吸去多余的平衡液。
2) 第二向垂直SDS-PAGE
根據(jù)IPG conversion Kit的體積,配制大小為200 mmX200 mmX 1mm,濃度為12.5%T,3.3%C的均勻膠。將平衡好的IPG膠條移至凝膠上方,用0.5%瓊脂糖電泳緩沖液封閉。電泳的緩沖液系統(tǒng)為Tris-Glycine-SDS系統(tǒng)(500 ml,SX,7.5 g Tris,2.5 g SDS,36 g Glycine)。一向膠條和二向膠接觸面避免氣泡產(chǎn)生;封膠溫度不能過(guò)高,封膠時(shí)不要引入氣泡。
電泳參數(shù)設(shè)置:14-15℃恒溫下,以每膠條計(jì)
20 mA恒流電泳40 min
30 mA恒流電泳至澳酚藍(lán)電泳到底部。
2. 染色
1) 銀染法:將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至固定液(40%無(wú)水乙醇,10%冰醋酸)中,固定30 min;棄固定液換敏化液(30%無(wú)水乙醇,6.8%醋酸鈉,0.2%*,0.5%戊二醛)敏化30 min;棄敏化液,以雙蒸水200 ml洗2次,每次30 min;之后置于銀染液((0.25%*,40%甲醛)染色20 min,染色時(shí)避光;棄銀染液,以雙蒸水200ml洗2次,每次1 min;顯色液((2.5%碳酸鈉,20%甲醛)顯色2-5 min,至蛋白質(zhì)點(diǎn)*顯現(xiàn)為止;棄顯色劑,立即換終止液(1.46 %EDTA),終止顯色10 min;以超純水洗3次,每次5 min。
2) 考馬斯亮藍(lán)染色(考染)法:將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至固定液(50%無(wú)水乙醇,10%冰醋酸的水溶液)中,固定30 min以上;棄固定液,加入染色液(10%冰醋酸,G-350過(guò)濾所得),熱染10 min;之后轉(zhuǎn)移至脫色液中(10%冰醋酸水溶液)過(guò)夜,直至背景色脫盡;超純水清洗。
3. 圖像分析
以ImageScanner光學(xué)掃描儀在256色和300 dpi分辨率下對(duì)凝膠進(jìn)行掃描。以Image Master 2D Elite 3.01分析軟件完成圖像分析。
4. 肽質(zhì)量指紋譜(Peptide mass fingerprinting,PMT)分析樣品制備
1) 脫色:選取2D膠上目的蛋白斑點(diǎn),用干凈解剖刀片沿染色邊緣切下蛋白點(diǎn),并切成1-2 mm大小的膠片,另切一塊無(wú)蛋白的2D膠作空白對(duì)照,用水清洗幾次后用含50%乙睛,25 mmol/I,NH4CO3溶液振搖20 min,棄去溶液,重復(fù)1-2遍至膠片中的藍(lán)色褪盡。
2) 酶切:將膠片真空離心干燥20 min,使其*脫水體積縮小,*用25 mmol/L NH4CO3溶液配成0.01ug/ul,加入10ul于各樣品管中,4℃冰箱中放置30 min,待酶液*被吸收,37℃保溫反應(yīng)(封口)12 h。
3) 肽提取:加5 % TFA(三氟醋酸)溶液120 ul于40℃保溫1h,吸出上清液,加2.5%TFA,50%ACN(乙睛)溶液120 ul于30oC保溫1h,吸出上清液,合并上清液,冰凍干燥。
5. 差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋譜分析
凍干后用10ul0.5%TFA溶解膚混合物或脫鹽后的提取液,用Bruker公司的質(zhì)譜儀REFLEX III基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight massspectrometry,MALDI-TOF-MS)進(jìn)行分析。取1ul點(diǎn)靶,另取1ul a-氰基-4-經(jīng)基肉桂酸溶于0.1 % TFA/50 % ACN的飽和溶液作基質(zhì),室溫干燥。質(zhì)譜儀采用激光波長(zhǎng)337 nm,反射檢測(cè)。
6. 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索初步鑒定蛋白質(zhì)
數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序根據(jù)輸入的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量范圍及膚指紋譜數(shù)據(jù)和其它一些參數(shù)在數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與這些參數(shù)相匹配的蛋白質(zhì)。
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