與其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)家一樣，Eva Nogales趕上了好時(shí)機(jī)。這位美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的教員現(xiàn)在可以利用新工具，解決幾年前根本無(wú)法解答的細(xì)胞分子機(jī)制問(wèn)題。

zui近，Nogales和同事、分子生物學(xué)家、CRISPR-Cas9的聯(lián)合發(fā)明人Jennifer Doudna的合作項(xiàng)目正是個(gè)好例子。她們都對(duì)R環(huán)十分感興趣。很多情況下，在DNA被CRISPR-Cas9剪切前，細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成一個(gè)由核苷酸構(gòu)成的R環(huán)。Nogales等人對(duì)化膿性鏈球菌中的R環(huán)進(jìn)行了成像，得到了近原子分辨率的結(jié)構(gòu)圖像，提示了Cas9酶在特定位點(diǎn)如何打開(kāi)DNA，并使其可用于CRISPR的分子剪刀。

這項(xiàng)工作zui突出的是科學(xué)家能快速地將功能與結(jié)構(gòu)起來(lái)，而且他們能把成像方法結(jié)合起來(lái)。一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法一直是X射線晶體衍射法。但有些生物分子太大或太小，難以結(jié)晶，因此不能采用X射線法。而且，一些分子在發(fā)揮功能時(shí)，會(huì)發(fā)生形態(tài)或朝向的變化，而結(jié)晶法無(wú)法捕捉這些變化。

現(xiàn)在，科學(xué)家擁有一個(gè)龐大的成像工具庫(kù)。低溫電子顯微鏡或化學(xué)家的核磁共振（NMR）成像等方法，都能在不結(jié)晶的情況下，獲得接近原子分辨率的結(jié)構(gòu)圖像，從而揭示分子的形狀、大小和方向。但并非所有方法對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的全部蛋白質(zhì)、核酸都有用。

經(jīng)驗(yàn)證明，沒(méi)有一個(gè)單一的方法足以探討細(xì)胞中發(fā)生的動(dòng)態(tài)行為和復(fù)雜的相互作用。的解決辦法是整合來(lái)自多個(gè)工具的圖像。

這種方法得到了諸多追隨者。斯坦福大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Roger Kornberg指出，每個(gè)方法都能提供一些重要信息，結(jié)合起來(lái)，就能實(shí)現(xiàn)1+1>2的效果。由于在揭示基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制方面的貢獻(xiàn)，Kornberg于2006獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。對(duì)于這一突破性研究，他使用的是X射線晶體衍射法?，F(xiàn)在，和其他晶體學(xué)家一樣，他開(kāi)始使用多種方法的結(jié)合。

Kornberg繼續(xù)分析RNA聚合酶II，但現(xiàn)在他把冷凍電鏡和晶體學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)。與晶體技術(shù)相比，冷凍電鏡可用于不易結(jié)晶的生物分子，并且能解析較大的分子，但目前分辨率則稍遜*。Kornberg實(shí)驗(yàn)室還使用化學(xué)交聯(lián)和質(zhì)譜法，揭示鄰近蛋白質(zhì)之間的關(guān)系以及利用已知蛋白質(zhì)信息進(jìn)行同源性建模。

同時(shí)，Nogales和Doudna團(tuán)隊(duì)也使用混合方法研究R環(huán)。Nogales表示，“高分辨率的X射線晶體法無(wú)法解析完整的R環(huán)結(jié)構(gòu)。”所以他們用冷凍電鏡在低分辨率上對(duì)完整的環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。只有把兩者結(jié)合起來(lái)，研究人員才能真正揭示CRISPR-Cas9中R環(huán)的作用。

這種混合或綜合性方法有助于研究人員深入研究基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題，對(duì)藥物也非常有用。細(xì)胞膜上的大蛋白質(zhì)往往是治療靶標(biāo)，高分辨率混合方法能揭示藥物與受體相互作用的原子細(xì)節(jié)。同樣，通過(guò)展示艾滋病病毒、埃博拉病毒和其他病原體的包膜蛋白與免疫細(xì)胞相互作用機(jī)制，能有助于疫苗發(fā)展。納什維爾范德堡大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Jens Meiler表示，這些結(jié)構(gòu)對(duì)人們理解免疫系統(tǒng)的工作機(jī)制非常重要。

Noglaes總結(jié)到：“這是混合方法的黃金時(shí)代。”

夢(mèng)想成真

德國(guó)歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)細(xì)胞生物和生物物理部主任Jan Ellenberg表示，這個(gè)時(shí)代對(duì)很多生命科學(xué)家來(lái)說(shuō)，是夢(mèng)想成真的時(shí)代。這個(gè)夢(mèng)想是從原子層面無(wú)縫銜接到細(xì)胞層面。針對(duì)細(xì)胞大分子的深入理解自然能解答結(jié)構(gòu)生物學(xué)的首要問(wèn)題：一個(gè)分子的結(jié)構(gòu)是怎么和其功能在一起的?

結(jié)構(gòu)生物學(xué)家工具箱中的每種技術(shù)都提供了不同的視角。生物學(xué)家相信，使用混合方法構(gòu)建的模型可以準(zhǔn)確地反映分子或復(fù)合體在細(xì)胞中的行為。Meiler說(shuō)：“你需要把這些技術(shù)結(jié)合起來(lái)，才能得到全面答案。”

X射線晶體衍射一直是確定蛋白質(zhì)原子結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)方法。在成立于1971年的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行擁有的大約12萬(wàn)個(gè)模型中，約有90%來(lái)自晶體學(xué)研究。

不過(guò)，對(duì)于結(jié)構(gòu)生物學(xué)家而言，該技術(shù)雖然分辨率高，但也有局限性。首先，樣品要高度純化，以產(chǎn)生有序的晶體。科學(xué)家通過(guò)分析原子如何散射光確定分子結(jié)構(gòu)。該技術(shù)需要有足夠的原子，以產(chǎn)生可測(cè)量的衍射圖案，并且每一個(gè)晶體必須是靜態(tài)的。因此，該方法不能揭示一個(gè)分子是如何運(yùn)動(dòng)的以及如何起作用的，也不能揭示它如何與其他系統(tǒng)互動(dòng)。

德國(guó)復(fù)雜系統(tǒng)研究所計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)小組組長(zhǎng)Gunnar Schroder指出，蛋白質(zhì)不僅僅是一個(gè)單一的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，“通常情況下，你想看到的是整個(gè)蛋白質(zhì)如何工作”。Schroder使用混合方法理解蛋白的行為和彼此間的。晶體技術(shù)能提供蛋白在脫離正常環(huán)境時(shí)的快照。但結(jié)構(gòu)生物學(xué)家需要其他方法補(bǔ)充晶體結(jié)構(gòu)信息，并提高他們對(duì)蛋白質(zhì)形態(tài)和功能的理解。

此外，許多蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞膜上的藥物靶點(diǎn)，是靈活而不穩(wěn)定的。為了讓這些蛋白質(zhì)形成晶體，研究人員經(jīng)常要在某種程度上改變它們。Meiler指出，改變樣本可能無(wú)法準(zhǔn)確反映分子的原生態(tài)以及其在細(xì)胞內(nèi)的排布方式。他把實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法結(jié)合，以便更好地理解分子結(jié)構(gòu)。“晶體法是很好的初始方法，但這個(gè)方法不足以提供功能方面的信息。”他說(shuō)。