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增強型BCA蛋白定量試劑盒濃縮型配方，能檢測更低濃度的蛋白

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產(chǎn)品型號PD-BCA-E

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更新時間：2017-03-16 22:35:06瀏覽次數(shù)：1035次

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BCA試劑盒

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上海炎熙生物科技有限公司

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產(chǎn)品簡介

增強型BCA蛋白定量試劑盒濃縮型配方，能檢測更低濃度的蛋白
BCA蛋白定量試劑盒是一種基于二喹啉甲酸比色法的總蛋白檢測和定量試劑盒，快速靈敏,穩(wěn)定可靠，離子型和非離子型去污劑對其影響較小。增強型BCA蛋白定量試劑盒采用濃縮型配方，能檢測更低濃度的蛋白，檢測范圍低至0.5到20 μg/ml。

詳細介紹

增強型BCA蛋白定量試劑盒

Enhanced Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination

貨號	組份A	組份B	組份C	BSA標準品
PD-BCA-E	250 ml	240 ml	12 ml	4 X 1 ml

BSA標準品為5 mg/ml BSA，溶于水中，含0.05%疊氮鈉。

本試劑盒可供480個試管或32塊96孔板測試用。

室溫運輸和儲存。如因溫度低或長時間放置出現(xiàn)沉淀，將其搖勻即可使用。BSA標準品保存在-20度，如出現(xiàn)微生物污染則應丟棄。

產(chǎn)品簡介

BCA蛋白定量試劑盒是一種基于二喹啉甲酸比色法的總蛋白檢測和定量試劑盒，比Lowry法更為*。BCA蛋白定量法以快速靈敏、穩(wěn)定可靠且對不同種類蛋白質(zhì)變異系數(shù)甚小而深受專業(yè)人士的青睞，樣品中離子型和非離子型去污劑對其影響較小，檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠小于考馬斯亮藍。BCA法的原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子，二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡合物，這種絡合物溶于水并在562 nm處產(chǎn)生光吸收峰值，光吸收強度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量呈近似線性關系，因此使用比色法可以對蛋白質(zhì)進行檢測和定量。BCA法沒有反應終點，反應會隨著時間而持續(xù)進行；通過一段時間的孵育后，反應速度會變慢，從而可以對大量樣品進行檢測。

在蛋白質(zhì)的大分子結構中，與BCA反應顏色形成相關的是肽鍵和四種氨基酸（半*，*，*，以及*）。對二肽、三肽和四肽的研究表明，反應顏色的形成不僅僅是單個的功能基團效果疊加的結果。因此，蛋白濃度通常是根據(jù)標準對照蛋白（常用牛血清白蛋白BSA）推測而來的，即：將標準對照蛋白的光吸收值做一個濃度梯度標準曲線，未知樣品的光吸收值參照曲線方程計算出蛋白濃度值。

增強型BCA蛋白定量試劑盒采用了濃縮型試劑配方，提高了孵育時間和溫度，因此可以增加樣品體積和增加光吸收值，從而能夠檢測更低濃度的蛋白，檢測范圍可低至0.5到20 μg/ml。

標準蛋白和工作液的配制

A. 配制牛血清白蛋白梯度：可根據(jù)檢測范圍和預估的蛋白濃度來配制BSA濃度梯度，使用與待測樣品相同的溶劑?？砂幢壤糯蠡蚩s小，根據(jù)實際需要計算所需用量。

B. BCA工作液的配制

1. 根據(jù)需要測定的未知樣品和蛋白標準品的數(shù)量以及復孔數(shù)來計算所需的BCA工作液體積。如使用試管進行測試，每管需1.0 mL工作液, 而使用96孔板進行測試則每孔需150 µl 工作液。

2. 按組份A:組份B:組份C = 25:24:1 的比例配制BCA工作液。組份C加入組份A+B的時候，開始會出現(xiàn)渾濁并隨著混勻很快消失，zui終混勻后溶液呈蘋果綠色。配置好的工作液在室溫密閉的條件下24小時內(nèi)穩(wěn)定。

操作步驟

1. 如在試管中進行反應，取1.0 ml的BSA蛋白梯度或者待測樣品，放入標記好的試管中，再每管加入1.0 ml 工作液，充分混勻，蓋上蓋子，并在60°C 孵育60 minutes, 檢測范圍： 0.5-20 μg/ml。

延長孵育時間會增加光吸收值；應使用水浴法加熱，以使得溫度均衡上升；用鼓風法升溫會導致溫度不均衡，使實驗誤差增大。

2. 如需在96孔板中進行反應，則每孔放入150 μl的BSA蛋白梯度或者待測樣品，再加入150 μl工作液，充分混勻，37度孵育120分鐘，檢測范圍為2-40 μg/ml；注意溫度不要高于37度，否則會出現(xiàn)背景升高和反應異常，大多數(shù)聚苯乙烯（polystyrene）微孔板會在60度出現(xiàn)霧化現(xiàn)象；應使用水浴法加熱。

3. 將試管或96孔板冷卻至室溫。

4. 用分光光度計或酶標儀在562 nm處讀取光吸收值, 所有樣品應在10分鐘內(nèi)讀完。因為BCA反應沒有終點，隨著時間的推移光吸收值會繼續(xù)上升，在10分鐘內(nèi)讀完所有樣品可以避免產(chǎn)生明顯的誤差。

5. 將BSA蛋白標準品和待測樣品的光吸收值減去空白對照值，以得到的蛋白標準品光吸收值對蛋白濃度作標準曲線，根據(jù)這個曲線方程計算待測樣品的蛋白濃度。

注意事項：

· 測定蛋白濃度時，使未知樣品的蛋白濃度處于標準擬合曲線的接近中間位置，這樣獲得的結果更準確。

通過增加孵育時間或者提高樣品比例，可以提高光吸收值，從而檢測更低的蛋白量，但是會縮小檢測范圍，可根據(jù)實際需要進行調(diào)整，同時注意不要超過儀器的檢測上限。

· zui適檢測波長為562 nm。在540 nm到590 nm區(qū)間也可進行檢測, 但標準曲線斜率和檢測靈敏度都會有所降低。

· 酶標儀的檢測光徑比分光光度計的比色杯短，因而檢測靈敏度有所降低。

· 用軟件對酶標儀的讀數(shù)進行曲線擬合時，采用best-fit polynomial equation進行擬合可以獲得比線性擬合更準確的結果；手工擬合時可采用線性擬合法。

· EDTA濃度必須小于0.5 mM，不兼容EGTA。不適用BCA法時，請使用Bradford蛋白濃度測定法。

· 每種常用的總蛋白測定方法測定不同的蛋白時都有一些偏差。導致產(chǎn)生這些偏差的原因有：蛋白質(zhì)的氨基酸序列，等電點，蛋白的結構，特定種類的氨基酸側鏈和輔基。有些種類的氨基酸側鏈和輔基能對顯色反應產(chǎn)生很大的影響。大部分蛋白測定方法都使用牛血清白蛋白（BSA）或免疫球蛋白(IgG)作為標準品來制作標準曲線。如果需要特別精確的檢測結果，可以使用待測蛋白的純品來制作標準曲線。

· 一些物質(zhì)可以干擾BCA反應，如還原劑、絡合劑，以及強酸和強堿。還有一些物質(zhì)干擾較小，只要不超過zui大兼容濃度即不影響反應的進行。詳見http://www.biothrive。。ｃｎ/Product/3650481235.html

· 本產(chǎn)品*于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

· 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常見問題

問題	可能原因	解決辦法
沒有顏色	樣品中含有銅離子絡合劑	1，透析，脫鹽，或稀釋樣品；或2，提高工作液中銅離子的濃度，如將組份C的比例增加一倍；或3，使用蛋白沉淀法去除干擾物
空白對照孔光吸收值正常，但是蛋白標準品和待測樣品光吸收值低于預期	樣品所用溶劑是強酸堿性緩沖液，改變了工作液的pH值	透析，脫鹽，或稀釋樣品
空白對照孔光吸收值正常，但是蛋白標準品和待測樣品光吸收值低于預期	光吸收波長選擇錯誤	在562 nm讀取光吸收值。
待測樣品孔光吸收值高于預期	蛋白濃度過高	稀釋樣品
	樣品中含有脂類或脂蛋白	向樣品中加入2% SDS以除去脂類干擾
	樣品中含有脂類或脂蛋白	使用蛋白沉淀法去除干擾物
所有孔，包括空白對照孔，呈暗紫色	緩沖液中含有還原劑	1,透析或稀釋樣品; 或2，使用蛋白沉淀法去除干擾物
	緩沖液中含有硫醇
	緩沖液中含有生物胺(兒茶酚胺)
需要用不同的波長讀取光吸收值	酶標儀或分光光度計沒有562 nm濾光片	可以讀取540 nm到590 nm區(qū)間的光吸收值, 但是標準曲線的斜率和檢測靈敏度都會降低。