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南京億迅生物科技有限公司

主營(yíng)產(chǎn)品: 質(zhì)控樣品,人工血清,人工胃液,elisa試劑盒,化學(xué)試劑,生物試劑

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乙醇脫氫酶(ADH)活性測(cè)定試劑盒

2019-11-19  閱讀(255)

提 供 商 南京億迅生物科技有限公司 資料大小 30.5KB
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【詳細(xì)說(shuō)明】

測(cè)定意義:

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換,在很多生理過(guò)程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物ADH主要在肝臟生成,肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測(cè)定原理:

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+,NADH340nm處有吸收峰,而NAD+沒(méi)有;測(cè)定340nm 吸光度下降速率,來(lái)計(jì)算ADH活性。

自備儀器和用品:

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,室溫保存。

試劑二:液體×1瓶,4保存。臨用前把試劑三轉(zhuǎn)移到試劑二中,4保存。                 

試劑三:粉劑×1瓶,-20保存。

試劑四:液體×1支,4保存。

粗酶液提?。?/span>

1、稱取約0.1g樣品,加試劑一1ml,冰上充分研磨,16000g 4離心20min,取上清待測(cè)。2、血清可以直接用于測(cè)定。

ADH測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25水浴中保溫30 min以上。

3. 空白管:在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑四,迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化,分別記錄15s75s時(shí)吸光值,分別記為A1A2。A空白管=A1-A2??瞻坠苤恍枳?/span>1~2個(gè)。

4. 測(cè)定管:在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑四,迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化,分別記錄15s75s時(shí)吸光值,分別記為A3A4。A測(cè)定管=A3-A4

ADH活性計(jì)算:

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 1U。

ADH (U/mg prot) =[(△A測(cè)定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V)÷T

=1.61×(△A測(cè)定管△A空白管) ÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 1U

ADH (U/g 鮮重) =[(△A測(cè)定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V÷V樣總×W)÷T

=1.61×(△A測(cè)定管△A空白管) ÷W

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W 樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1)按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 1U。

ADH (U/mg prot) =[(△A測(cè)定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V)÷T

=3.22×(△A測(cè)定管△A空白管) ÷Cpr

2按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 1U。

ADH (U/g 鮮重) =[(△A測(cè)定管△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V÷V樣總×W)÷T

=3.22×(△A測(cè)定管△A空白管) ÷W

εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cmd96孔板光徑,0.5 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W 樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min

注意事項(xiàng):

上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。



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