南京億迅生物科技有限公司
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乙醇脫氫酶(ADH)活性測(cè)定試劑盒
2019-11-19 閱讀(255)
提 供 商 | 南京億迅生物科技有限公司 | 資料大小 | 30.5KB |
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資料圖片 | 下載次數(shù) | 39次 | |
資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 255次 |
測(cè)定意義:
ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換,在很多生理過(guò)程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物ADH主要在肝臟生成,肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。
測(cè)定原理:
ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+,NADH在340nm處有吸收峰,而NAD+沒(méi)有;測(cè)定340nm 吸光度下降速率,來(lái)計(jì)算ADH活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體×1瓶,室溫保存。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。臨用前把試劑三轉(zhuǎn)移到試劑二中,4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存。
試劑四:液體×1支,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、稱取約0.1g樣品,加試劑一1ml,冰上充分研磨,16000g 4℃離心20min,取上清待測(cè)。2、血清可以直接用于測(cè)定。
ADH測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴中保溫30 min以上。
3. 空白管:在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑四,迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化,分別記錄15s和75s時(shí)吸光值,分別記為A1和A2。△A空白管=A1-A2??瞻坠苤恍枳?/span>1~2個(gè)。
4. 測(cè)定管:在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑四,迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化,分別記錄15s和75s時(shí)吸光值,分別記為A3和A4。△A測(cè)定管=A3-A4。
ADH活性計(jì)算:
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/mg prot) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V樣)÷T
=1.61×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/g 鮮重) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=1.61×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷W
ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/mg prot) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V樣)÷T
=3.22×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
活性單位定義:25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/g 鮮重) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=3.22×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷W
ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.5 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min。
注意事項(xiàng):
上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。