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測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

AND催化氨基比林釋放甲醛，通過Nash比色法測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出AND活性。

自備儀器和用品：

普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇和冰。

試劑組成和配置：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加入1mL無水乙醇，充分溶解。

試劑四：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入0.5mL蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水4mL充分溶解。

試劑六：液體×1瓶，室溫保存。

試劑七：液體×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5mL EP 管，加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。

AND活性測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min以上。

3. 空白管：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL試劑二，10μL試劑三，10μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入100μL上清液，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A空白管。每個(gè)樣品都需要做空白管。

4. 測(cè)定管：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL試劑二，10μL試劑三，10μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入100μL上清液，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1支EP管，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品，100μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

AND活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位（U）定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1μmol甲醛。

AND活性(U/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

=0.045×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

活性單位（U）定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1μmol甲醛。

AND活性(U/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.045×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W。

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），30min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位（U）定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1μmol甲醛。

AND活性(U/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

=0.045×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

活性單位（U）定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1μmol甲醛。

AND活性(U/g 鮮重)  = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.045×（A測(cè)定管－A空白管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W。

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），30min。

注意事項(xiàng)：

1、粗酶液需在當(dāng)日完成測(cè)定，如需保存，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分裝后，-80℃保存；

2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當(dāng)天沒有用完，4℃避光保存，可用1周；

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測(cè)定，建議用BCA法測(cè)蛋白含量。