T4 GP61 Primase

描述：T4 噬菌體復(fù)制分為依賴于起始子的起始復(fù)制和依賴于重組酶的復(fù)制。由起始復(fù)制產(chǎn)生的 3’-ssDNA 作為重組復(fù)制的步鏈侵入的組份，該 3’-ssDNA 被 T4 gp32蛋白所覆蓋，同時將 T4 UvsY 募集到此；T4 UvsY 作為T4 UvsX 的 loader 將其運(yùn)載至此，于此同時 gp32 被置換下來， UvsX 和 UvsY 形成突觸結(jié)構(gòu)， 然后侵入同源的雙鏈形成 D-Loop， 一旦形成 D-Loop， UvsX 即被置換下來。D-loop 被置換鏈作為滯后鏈合成的模板，很快被gp32 結(jié)合。隨后， 解旋酶 loader gp59 與 gp32 覆蓋的DNA 復(fù)制叉結(jié)合，將 gp41/61 運(yùn)載至此， gp61 引發(fā)酶可合成引物片段促進(jìn)滯后鏈上 DNA 的合成，而 gp41 通過解旋模板而促進(jìn)先導(dǎo)鏈的 DNA 合成。最后，聚合酶的滑板蛋白 gp45 和其 loder 蛋白 gp44/62 與先導(dǎo)鏈相結(jié)合，促進(jìn)聚合酶 gp43 的組裝，gp45 將 gp43 運(yùn)載至復(fù)制叉處后啟動先導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成，gp44/62 隨后從復(fù)制叉處解離。gp61 引發(fā)酶可合成寡核苷酸用于引發(fā)滯后鏈上岡崎片段的合成，因此，gp61 引發(fā)酶在 T4 噬菌體 DNA滯后鏈的合成中起重要作用。
儲存：-20℃。
Storage Buffer：
20mM Tris-HCl，pH7.5
200mM NaCl
5mM DTT
50% Glycerol

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。