HG TaqMan miRNA定量PCR試劑盒

描述：HG TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒， 采用特異性的正向 miRNA 引物和接頭引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 增，檢測(cè)熒光基團(tuán)采用 FAM 標(biāo)記的特異性 miRNA TaqMan 探針（原理見(jiàn)圖 1）。使用該試劑盒可以特異性、 高靈敏度的檢測(cè)低至 100 個(gè)細(xì)胞的 miRNA 分子。 的 TaqMan miRNA 定量 PCR 試劑盒共有一萬(wàn) 余種，每一個(gè) mircoRNA 分 子對(duì)應(yīng)一個(gè)檢測(cè)試劑盒（包含特異性的 TaqMan 探針、正 向引物、反向引物、定量試劑），可在 HG TaqMan miRNA qPCR kit.xls 中查詢。如果您研究的 mircoRNA 分子不在 我們的列表中，請(qǐng)來(lái)信咨詢，我們將及時(shí)給您優(yōu)化設(shè)計(jì)。 內(nèi)參基因可選擇使用： （1）TaqMan RNU6B miRNA 定量 PCR 試劑盒適用于人、鼠等哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞樣品； （2）TaqMan hsa-miR16 miRNA 定量 PCR 試劑盒適用于來(lái)源于人、鼠全血樣品。

組分：

儲(chǔ)存：避光置于-20°C，可保存 2 年；避免反復(fù)凍融
1 配制反應(yīng)體系(20μl)
5×Golden HS TaqMan qPCR Mix 4 μl
20×miRNA TaqMan Assay 1 μl
*cDNA 模板 1～2.5 μl
ddH2O Up to 20 μl
2 進(jìn)行 Real-Time PCR 反應(yīng)
通常采用兩步法，程序如下：
 Stage 1: 95℃ 15 min（熱啟動(dòng)，不可縮短時(shí)間）
 Stage 2: 95℃ 10 s
 60℃ 30 s 40cycles
（收集信號(hào)采用 FAM 染料通道，Rox 矯正信號(hào)選擇 None）
3 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-Time PCR 的 cDNA 樣品和 NTC
陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。