NHS活化磁珠

NHS-Activated Magnetic Beads 是均勻的，表面覆蓋有高密度NHS（N-羥基琥珀 酰亞胺） 官能團(tuán)的磁珠。磁珠通過(guò)形成穩(wěn)定的酰胺鍵方式，快速、高效的共價(jià)結(jié)合任何含有伯胺的配 體(圖 1）。本款磁珠可以在偶聯(lián)條件下快速完成反應(yīng)（室溫 pH 6.5-9 下 15-30 分 鐘，4℃ 下 4 小時(shí)），且不需要危險(xiǎn)化學(xué)品。 NHS-activated Magnetic Beads 適于結(jié)合大分子蛋白。 Long-arm NHS-activated Magnetic Beads 被推薦用于結(jié)合小肽分子， 因?yàn)槠溟L(zhǎng)臂（21-原子） 的親水連接基團(tuán)可以減少位阻現(xiàn)象。 NHS-activated Magnetic Beads 可以地作為親和樹(shù)脂進(jìn)行親和純化，將分子、 細(xì)胞和 部分細(xì)胞提取物進(jìn)行提煉純化。在與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標(biāo)分子的樣品中，然 后混合、孵育、洗滌和洗脫目標(biāo)分子（圖2）。

產(chǎn)品特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)：

·預(yù)活化即用型磁珠

·便于使用

·在pH7.4，4℃-25℃條件下可以快速偶聯(lián)

·穩(wěn)定的共價(jià)鍵，低水平的配體泄漏

·可重復(fù)使用的免疫親和基質(zhì)

·極低的非特異性結(jié)合率

·用途：用于純化抗體，蛋白質(zhì)/肽，DNA / RNA;細(xì)胞篩選、免疫沉淀

操作步驟

提示：

強(qiáng)烈建議在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行滴定優(yōu)化，以確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相應(yīng)地放大和縮小。避免使用含有 tris 或其他含有伯胺類試劑的緩沖液，因?yàn)樗鼈兣c預(yù)期的偶聯(lián)反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。

1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當(dāng)磁珠沉淀時(shí)， 去除上清液。 

2.取下試管，加入 5 倍磁珠溶液體積的 PBS 緩沖液，通過(guò)震蕩重新懸浮磁珠，渦旋 30 秒。將試管至于室溫環(huán)境 1-3 分鐘，再將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當(dāng)磁珠沉淀 時(shí)，去除上清液。 

3.重復(fù)步驟 2 兩次。 

4.向含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過(guò)的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴 1-2 小時(shí) （溫度越低，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)）。提示：強(qiáng)烈建議進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間。因?yàn)榉趸?的時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致很高的背景。 

5.用 5 倍磁珠體積的 PBS 緩沖液或 1M NaCl 清洗磁珠，直到 280nm 處洗脫液的吸 光度接近背景水平（OD 280<0.05）。提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也 可能會(huì)降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加 NaCl（濃度為 1-1.5 M）、0.1-0.5% 的非離子洗滌劑，如 TritonX-100 或 Tween-20，以及還原劑，如 DTT 或 TCEP（我們通 常使用 3mM）。 6.通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒?，如?pH（2-4）、高 pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或 SDS-PAGE 上樣緩沖液中煮沸，洗脫目標(biāo)蛋白。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。