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當(dāng)前位置:西安百螢生物科技有限公司>>磷酸二酯酶>> 13622Amplite 熒光法酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒

Amplite 熒光法酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒

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產(chǎn)品型號(hào)13622

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所  在  地西安市

更新時(shí)間:2024-01-30 09:10:46瀏覽次數(shù):152次

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Amplite 熒光法酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒 紅色熒光是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)鞘磷脂的試劑盒,鞘磷脂酶(SMase)是一種酶,負(fù)責(zé)將鞘磷脂(SM)切割成磷酸*堿和神經(jīng)酰胺。

Amplite 熒光法酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒 紅色熒光是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)鞘磷脂的試劑盒,鞘磷脂酶(SMase)是一種酶,負(fù)責(zé)將鞘磷脂(SM)切割成磷酸*堿和神經(jīng)酰胺。SMase的在細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用,例如細(xì)胞生長調(diào)節(jié),細(xì)胞分化,細(xì)胞周期停滯和程序性細(xì)胞死亡。已經(jīng)基于它們的陽離子依賴性和佳作用pH鑒定了五種類型的鞘磷脂酶(SMase)。 它們是溶酶體酸性SMase,分泌鋅依賴性酸性SMase,鎂依賴性中性SMase,鎂非依賴性中性SMase和堿性SMase。在五種類型的鞘磷脂酶中,溶酶體酸性SMase和鎂依賴性中性SMase被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的主要因素。

我們的Amplite 熒光酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒是檢測(cè)酸性SMase活性或篩選其抑制劑的靈敏方法之一。該試劑盒使用Amplite™Red作為熒光探針,間接定量鞘磷脂酶(SMase)水解鞘磷脂(SM)產(chǎn)生的磷酸*堿。Amplite Red的熒光強(qiáng)度與磷酸*堿的形成成正比,因此與SMase活性成正比。 它可用于測(cè)量血液,細(xì)胞提取物或其他溶液中的SMase活性。該試劑盒是一種優(yōu)化的“混合和讀數(shù)"測(cè)定,與HTS液體處理儀器兼容。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 熒光法酸性鞘磷脂酶檢測(cè)試劑盒 紅色熒光。

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備鞘磷脂工作溶液(50μL)

添加SMase標(biāo)準(zhǔn)品和/或SMase測(cè)試樣品(50μL)

在37°C孵育1-2小時(shí)加入鞘磷脂酶測(cè)定混合物(50μL)

在室溫下孵育持續(xù)1-2小時(shí)

監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm處的熒光強(qiáng)度(在570 nm處截止)

注意:在開始實(shí)驗(yàn)之前,在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分的一個(gè)小瓶(或瓶)。

操作方法

1.準(zhǔn)備鞘磷脂工作液:

將50μL鞘磷脂(組分B)加入5mL SMase反應(yīng)緩沖液(組分D)中,并充分混合。

注意:應(yīng)及時(shí)使用鞘磷脂工作液。

2.制備鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品和/或含鞘磷脂酶的樣品:

2.1將20μL含0.1%BSA的PBS加入到鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品(組分F)的小瓶中,制成10單位/ mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

注意:應(yīng)將未使用的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液等分并保存在-20℃。

2.2將1μL的10單位/ mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(來自步驟2.1)加入1000μL測(cè)定緩沖液(組分E)中以產(chǎn)生10mU / mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品。

注意:稀釋的鞘磷脂標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液不穩(wěn)定,應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

2.3取500μL10mU / mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1至2次連續(xù)稀釋,得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 mU / mL連續(xù)稀釋的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品。

2.4將連續(xù)稀釋的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品和/或含鞘磷脂酶的測(cè)試樣品加入固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中,如說明書中的表1和2所示。

注意:根據(jù)需要處理您的細(xì)胞或組織樣本。

2.5將50μL鞘磷脂工作溶液(來自步驟1)加入到鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品,空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中(來自步驟2.4)。

2.6將反應(yīng)混合物在37℃下孵育1-2小時(shí)。

3.準(zhǔn)備200X Amplite Red原液:

將80μLDMSO(組分G)加入到Amplite Red(組分C)的小瓶中以制備200X Amplite Red儲(chǔ)備溶液。

注意1:未使用的Amplite Red原液應(yīng)等分并保存在-20℃(避光)。

注意2:在硫醇(如DTT和2-巰*乙醇)存在下,Amplite Red不穩(wěn)定。反應(yīng)中DTT或2-巰*乙醇的終濃度應(yīng)低于10μM。 Amplite Red在高pH(> 8.5)下也不穩(wěn)定。反應(yīng)應(yīng)在pH 7-8下進(jìn)行。建議將pH 7.4用于測(cè)定緩沖液。

4.準(zhǔn)備鞘磷脂酶測(cè)定混合物:

4.1將5 mL測(cè)定緩沖液(組分E)加入酶混合物瓶(組分A)中,并充分混合。

4.2在開始測(cè)定之前,將25μL的200X Amplite Red儲(chǔ)備溶液(來自步驟3)加入到酶混合物溶液瓶(來自步驟4.1)中以制備鞘磷脂酶測(cè)定混合物。

注意:應(yīng)立即使用鞘磷脂酶試驗(yàn)混合物并避光; 較長的儲(chǔ)存可能會(huì)導(dǎo)致高分析背景。

5.運(yùn)行鞘磷脂酶測(cè)定:

5.1將50μL鞘磷脂酶測(cè)定混合物(來自步驟4.2)加入鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品,空白對(duì)照和測(cè)試樣品(來自步驟2.4)的每個(gè)孔中,以使總鞘磷脂酶測(cè)定體積為150μL/孔。

注意:對(duì)于384孔板,每孔加入25μL樣品,25μL鞘磷脂工作溶液和25μL鞘磷脂酶測(cè)定混合物。

5.2在室溫下孵育反應(yīng)混合物1-2小時(shí)(避光)。

5.3使用熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 540 / 590nm(在570nm處截止)觀察熒光增加。



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