操作方法

以下方案是鉀鹽和鈉鹽制備的一個(gè)例子，它可以適用于大多數(shù)細(xì)胞類型和體內(nèi)動(dòng)物用途。

1.用于體外生物發(fā)光圖像測(cè)定的實(shí)施方案

1.1在無(wú)菌水中制備100mM（100-200X）熒光素原液，混合均勻。隨配隨用，或使用等分試樣，其他等分儲(chǔ)存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

1.2在預(yù)熱的組織培養(yǎng)基中制備0.5-1mM D-熒光素的工作溶液。

1.3從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離培養(yǎng)基。

1.4將熒光素工作溶液加入細(xì)胞中，并在成像前將細(xì)胞在37°C孵育5-10分鐘。

2.用于體內(nèi)生物發(fā)光圖像測(cè)定的實(shí)施方案

2.1在DPBS中制備15mg / mL熒光素儲(chǔ)備溶液，不含Mg2+和Ca2+。 混合均勻。

2.2通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾溶液。隨配隨用或單獨(dú)使用等分試樣，其余等分儲(chǔ)存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

2.3在動(dòng)物體重150mg / kg（或10μL/ g熒光素儲(chǔ)備溶液）成像10-15分鐘在腹膜內(nèi)（i.p.）注射熒光素。

注意：應(yīng)對(duì)每種動(dòng)物模型進(jìn)行熒光素的動(dòng)力學(xué)研究，以確定峰值信號(hào)時(shí)間。

3.熒光素報(bào)告分析分子測(cè)定的實(shí)施方案

3.1在無(wú)菌水中制備100mM熒光素儲(chǔ)備溶液。 隨配隨用或單獨(dú)使用等分試樣，其余等分儲(chǔ)存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

3.2制備1mM D-熒光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO4的25mM tricine緩沖液，pH7.8。

3.3將5-10μl細(xì)胞裂解液移入微孔板中。使用不含裂解液的裂解試劑或緩沖液作為空白對(duì)照。

3.4根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用熒光素工作溶液的普利光度計(jì)。

3.5注入200μl熒光素工作溶液。

注意1：D-熒光素鉀鹽溶于無(wú)菌水和緩沖液，溶解度可高達(dá)25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時(shí)間對(duì)其保存過(guò)程中的穩(wěn)定性非常重要。當(dāng)溶液的pH<6.5（發(fā)生水解作用）或>7.5（發(fā)生消旋化作用，D型轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型）的情況下，D-熒光素鉀鹽相對(duì)不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣，將加速D-熒光素鉀的降解速度。儲(chǔ)備溶液可以在不含ATP的水中制備，并在-20°C下避光儲(chǔ)存。必須用適當(dāng)?shù)膲A中和游離酸溶解。

注意2：D-熒光素可與任何現(xiàn)有的文獻(xiàn)或ATP分析系統(tǒng)一起使用。

注意3：如果檢測(cè)ATP，請(qǐng)戴上手套并使用無(wú)ATP容器，盡量減少所有可能的ATP污染源。僅使用無(wú)菌無(wú)ATP水和試劑。使用高壓水進(jìn)行所有試劑制備。