Amplite 熒光法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒是一種464kD的四聚體。β-半乳糖苷酶的每個(gè)單元由五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中第三個(gè)是活性位點(diǎn)。它是細(xì)胞中的一種必需酶。這種酶的缺乏會(huì)導(dǎo)致半乳糖苷中毒或莫奎奧B綜合征。在大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶是通過激活LacZ操縱子而產(chǎn)生的。LacZ表達(dá)的檢測已成為常規(guī)，檢測到的-每細(xì)胞半乳糖苷酶。該試劑盒使用熒光半乳糖苷酶底物，可以敏感地區(qū)分LacZ+和LacZ細(xì)胞。它可以用于檢測ELISA型檢測系統(tǒng)中的半乳糖苷酶綴合物或用于監(jiān)測細(xì)胞中LacZ基因的表達(dá)。半乳糖苷酶裂解產(chǎn)物的發(fā)射光譜可以用大多數(shù)配備FITC濾波片的熒光儀器檢測。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 熒光法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒。

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1.用LacZ基因制備穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞
2.用測試化合物孵育細(xì)胞（樣品）
3.裂解細(xì)胞
4.將裂解液轉(zhuǎn)移至微量滴定板
5.添加FDG工作解決方案
6.根據(jù)細(xì)胞類型，在室溫或37°C孵育至少5分鐘
7.添加停止解決方案
8.監(jiān)測Ex / Em = 490/525 nm的熒光強(qiáng)度

溶液制備 

1.儲(chǔ)備溶液

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1 FDG儲(chǔ)備溶液（1倍）：
將125 µL DMSO（組分E）加入FDG（組分A）小瓶中，制成1X FDG儲(chǔ)備液。 注意：25 µL FDG足以裝滿1個(gè)板，避光。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液

β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品
可選（如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線）：用0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液制備一系列β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液。 將標(biāo)準(zhǔn)曲線上每個(gè)點(diǎn)的等分試樣50 µL轉(zhuǎn)移至平板的對(duì)照孔中。 β-半乳糖苷酶的高推薦量為200 mU / mL（200-400 ng）。 建議對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行2倍系列稀釋，包括8個(gè)點(diǎn)。 注意：調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線以適合特定的實(shí)驗(yàn)條件，例如細(xì)胞類型，數(shù)量，轉(zhuǎn)染效率和培養(yǎng)板的大小。 每次進(jìn)行測定時(shí)，必須新鮮制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液。

3.工作溶液

3.1 0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液：
將30 µLβ-巰基乙醇（組分F）添加到10 mL反應(yīng)緩沖液（組分B）中，并充分混合。
注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 FDG工作方案：
將25 µL 1X FDG儲(chǔ)備溶液加到5 mL的0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液中。 注意：請(qǐng)勿將FDG溶液在室溫下長時(shí)間放置，否則會(huì)發(fā)生自發(fā)水解。

3.3 裂解緩沖液工作液：
使用前，將5 µLβ-巰基乙醇（組分F）加入5 mL裂解緩沖液（組分D）中。 注意：在裂解細(xì)胞之前，將0.1％β-巰基乙醇添加到裂解緩沖液中

樣品操作及分析

表1.細(xì)胞培養(yǎng)板推薦的Lysis Buffer工作溶液體積

1.從哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備細(xì)胞提取物

1.1用測試化合物處理含有LacZ基因的細(xì)胞所需的時(shí)間。

1.2用1X PBS洗滌細(xì)胞兩次。不要移動(dòng)細(xì)胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相應(yīng)地裂解細(xì)胞。

1.3.1對(duì)于貼壁細(xì)胞：將Lysis Buffer工作溶液添加至培養(yǎng)板。有關(guān)建議的數(shù)量，請(qǐng)參見表1。

1.3.2對(duì)于非貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞沉淀到離心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取決于細(xì)胞沉淀的大?。?。

1.4將上一步的細(xì)胞在室溫下孵育10-15分鐘，然后輕輕旋轉(zhuǎn)平板或試管數(shù)次以確保裂解。

1.5繼續(xù)進(jìn)行FDG測定或?qū)悠吩?80°C下冷凍直至使用。注意：通過快速的凍融循環(huán)（在-20°C到-80°C冷凍1-2小時(shí)，然后在室溫解凍）也可以獲得良好的裂解?；蛘?，將細(xì)胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶物，然后測定上清液。

2.運(yùn)行?-半乳糖苷酶測定

2.1如果需要，在室溫下解凍裂解細(xì)胞管或板。如果細(xì)胞接種在96孔板上，則直接在96孔板上進(jìn)行測定。

2.2在96孔板的每個(gè)孔中加入50 µL細(xì)胞提取物。如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，請(qǐng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線保存一些對(duì)照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率很高時(shí)，可在裂解緩沖液工作溶液中稀釋裂解液，或在轉(zhuǎn)染效率低時(shí)減少裂解液的體積。如果在96孔板上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，或?qū)⒎€(wěn)定的細(xì)胞系接種到96孔板上，請(qǐng)直接在板上進(jìn)行測定。對(duì)于內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性控制，請(qǐng)?zhí)砑?0 µL非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞裂解液。對(duì)于空白對(duì)照，添加50 µL 1X裂解緩沖液。

2.3向每個(gè)孔中加入50 µL FDG工作溶液。根據(jù)細(xì)胞類型，將板在室溫或37°C下孵育大約5分鐘至4小時(shí)。

2.4向每個(gè)孔中添加50 µL終止緩沖液（組分C）。終止緩沖液除了終止反應(yīng)之外，還引起產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度增加。

2.5用熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 490/525 nm處測量每個(gè)孔中溶液的熒光強(qiáng)度。

2.6根據(jù)線性標(biāo)準(zhǔn)曲線定量?-半乳糖苷酶表達(dá)。