熒光素標(biāo)記磷酸化熱休克蛋白27抗體IgG，一、酶標(biāo)記

1、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記

辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。這里介紹兩種程序。

程序一：

（1）將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。

（2）加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。

（3）加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。

（4）稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下*玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi);隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套;蓋緊，室溫作用（避光）3小時(shí)或4℃過夜。

（5）用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘;再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)（或4℃過夜）。

（6）將交聯(lián)物過Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）層析純化，分管收集*峰。

（7）酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：

克分子比值測定

酶量（mg/ml）=OD403×0.4

IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62

克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之間。酶結(jié)合率=酶量×體積/抗體，標(biāo)記率一般為0.3-0.6，即1-2個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上，標(biāo)記率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4時(shí)，E/P約為1。

標(biāo)記率=OD403/OD280

酶活性和抗體活性的測定可應(yīng)用ELISA法、免疫擴(kuò)散、DAB-H2O2顯色反應(yīng)測定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價(jià)、特異性。

（8）HRP抗體結(jié)合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃存放，防止反復(fù)凍融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐，否則會影響酶活性。必要時(shí)凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。

程序二：

（1）將5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無水乙醇溶液0.1ml，室溫?cái)嚢枳饔?小時(shí)，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。

（2）再加1ml 0.06mol/L 過碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色;隨后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，輕攪1小時(shí)，中止氧化反應(yīng)。

（3）移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過夜，更換三次緩沖液，注意避光。

（4）吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫輕攪2-3小時(shí)，避光;加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小時(shí)或過夜，或換用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小時(shí)。

（5）再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小時(shí)，更換三次緩沖液。

（6）用3000r/min離心30分鐘，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析三次，沉淀用少許PBS溶解，透析或?qū)游龀}，必要時(shí)進(jìn)一步層析純化。

（7）、（8）步驟同程序一。

2、堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記

堿性磷酸酶（AP）用于標(biāo)記抗體，常用戊二醛一步法，將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個(gè)醛基結(jié)合，制備成結(jié)合物。該法簡便，但所得產(chǎn)物不均一，抗體活性損失大，酶標(biāo)記率低。其程序如下：

（1）將5mg AP加入1ml抗體溶液（2mg/ml）中溶解，裝入透析袋，于4℃對0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時(shí)，換液三次。

（2）加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時(shí)，4℃對PBS透析過夜，其間換液三次。

（3）換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過夜，換液三次。

（4）取出標(biāo)記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標(biāo)記物原液。

（5）每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩?br />
3、PAP、APAAP的制備

PAP（過氧化物酶-抗過氧化物酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)）、APAAP（堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)）的制備對于日益廣泛使用單抗的免疫細(xì)胞化學(xué)有重要意義?，F(xiàn)在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應(yīng)，只要配以相應(yīng)的橋抗體，即可非常便利地應(yīng)用單抗。因?yàn)镻AP法和APAAP法不用任何化學(xué)交聯(lián)劑處理酶和抗體，它們的活性均不受化學(xué)因素的影響，提高了敏感性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得免疫沉淀物，再加入酶鹽水，過量的酶有助于免疫沉淀物的解離反應(yīng)，調(diào)PH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAP。

根據(jù)需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應(yīng)橋抗體結(jié)合后，再與特定單抗組成完整的診斷試劑，這樣，單抗即可一步法用于診斷或檢測試驗(yàn)等。

熒光素標(biāo)記磷酸化熱休克蛋白27抗體IgG，二、熒光素標(biāo)記

1、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記

FITC標(biāo)記抗體的原理是在堿性條件下，F(xiàn)ITC 的異硫氰基能與IgG的自由氨基結(jié)合，形成IgG與熒光素的結(jié)合物。FITC是zui常用的熒光素，其次選用TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）。FITC和TRITC是常用的雙標(biāo)記組合。其標(biāo)記步驟如下：

（1）以碳酸鹽緩沖液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸餾水1000ml）調(diào)整抗體濃度至10mg/ml。

（2）取5ml抗體溶液置于10ml小燒杯中。

（3）稱取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內(nèi)，邊加邊輕攪;其后室溫避光作用2小時(shí)。

（4）將交聯(lián)物經(jīng)Sephadex G25或G50柱層析除去游離的熒光素;分管收集*峰為標(biāo)記的抗體。

（5）FITC的結(jié)合物質(zhì)量鑒定

IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4

F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般說，F(xiàn)ITC對抗體的摩爾比為3：1時(shí)適合于組織切片染色，為5-6：1時(shí)適合于細(xì)胞懸液染色。以標(biāo)記抗體染色各種抗原，測定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。

（6）標(biāo)記抗體的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。

2、異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記： 基本與FITC標(biāo)記相同。

，三、同位素標(biāo)記

必須強(qiáng)調(diào)的是在使用同位素標(biāo)記單抗或其他蛋白之前，應(yīng)掌握同位素操作和防護(hù)知識。正常情況下應(yīng)包括避免物理的接觸和對γ-射線照射的有效保護(hù)，操作和使用同位素標(biāo)記抗體時(shí)，應(yīng)利用防護(hù)裝置，并合理處置含放射性的廢料。

1、碘標(biāo)記

用碘標(biāo)記抗體是一種有效的標(biāo)記方法。125I衰變產(chǎn)生低能的γ和Χ射線，很容易被檢測出來，而其60天的半衰期保證足夠的有效使用期，且能很方便地處理放射廢料。zui常用的碘標(biāo)記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入到抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉(zhuǎn)化成I2，游離I2可與抗體分子中*和一些*發(fā)生鹵化反應(yīng)，用還原劑和游離*終止反應(yīng)，經(jīng)凝膠過濾將標(biāo)記的抗體與碘化*及還原劑分離開。其主要操作步驟如下：

（1）在進(jìn)行標(biāo)記之前，先選用截流分子量為20000-50000的凝膠，制備1ml凝膠柱，然后分別用10倍體積的1%BSA/PBS/0.02%疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。

（2）加入10ug純化單抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸鈉（PH7.5）的1.5ml指形管內(nèi)。隨后，加入500uCi Na125I混勻。

（3）加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室溫放置60秒。再加入50ul氯胺T終止液（含2.4mg/ml偏重亞硫酸鈉，10mg/ml*，10%甘油和0.1%環(huán)乙烷酰二甲苯的PBS）。

（4）將上述碘標(biāo)記物上樣在凝膠柱表面，小心放開柱體下口，用1.5ml指形管收集。當(dāng)?shù)鈽?biāo)記物全部進(jìn)入柱體，加入0.3ml含0.03%疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重復(fù)進(jìn)行，同時(shí)用同位素檢測儀測定標(biāo)記與未標(biāo)記的單抗。標(biāo)記抗體大約在第二至第四管出現(xiàn)。無害化處理柱子和非單抗標(biāo)記部分。

（5）將標(biāo)記單抗保存于4℃可使用6周時(shí)間。

2、生物合成法標(biāo)記

將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含有放射性前體的培養(yǎng)基中，隨著抗體分子的合成、組裝，同位素會標(biāo)記在抗體分子的初級氨基酸鏈上，本方法不會導(dǎo)致抗體活性的喪失。其主要步驟是：

（1）離心收集處于對數(shù)生*的雜交瘤細(xì)胞，約需2×106個(gè)細(xì)胞。以預(yù)熱37℃不含*的培養(yǎng)基洗滌上述細(xì)胞。

（2）用含2% PBS不含*的培養(yǎng)基懸浮雜交瘤細(xì)胞至106個(gè)/ml，加入35S*（每次加入100uCi可產(chǎn)生105-106cpm的抗體）。

（3）經(jīng)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，離心后，吸出培養(yǎng)上清，分別加入1/20體積的1mol/L Tris（PH8.0）及疊氮鈉至濃度0.02%。該標(biāo)記抗體可按純化單抗方法進(jìn)行。

，四、*標(biāo)記

*標(biāo)記反應(yīng)常用*琥珀酰亞胺酯進(jìn)行。*是與抗體分子的游離賴氨酸等發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而完成標(biāo)記。其主要步驟是：

1、用二甲基亞砜配制10mg/ml的N-羥琥珀酰亞胺*（應(yīng)根據(jù)需要選用不同大小和間臂長的*化琥珀酰酯）。

2、用硼酸鈉緩沖液（0.1mol/L，PH8.0）稀釋單抗溶液至1-3mg/ml。

3、每毫克抗體加入25-250ug的*酯，混勻后，室溫作用4小時(shí)。

4、按每250ug*酯加入20ul 1mol/L NH4Cl終止反應(yīng)，室溫放置10分鐘。

5、以PBS充分透析除去游離*，標(biāo)記抗體凍存。

，五、其他標(biāo)記技術(shù)

適用于蛋白質(zhì)的其他標(biāo)記方法也可用于單抗，如金標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、SPA標(biāo)記、鐵蛋白標(biāo)記等。

免疫標(biāo)記是一種操作簡單、靈敏度高的技術(shù)，主要原理是級聯(lián)方法效應(yīng)。單抗已經(jīng)廣泛用于疾病診斷等，主要是利用單抗標(biāo)記的診斷試劑盒進(jìn)行的。