產(chǎn)品編號(hào)： EIA06202
使用前*閱讀說(shuō)明書(shū)。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于經(jīng)典酶聯(lián)夾心技術(shù)原理，能測(cè)量大鼠TLR4，只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。

工作原理
Toll樣受體（Toll-1ike receptor，TLRs）是一種模式識(shí)別受體，識(shí)別病原微生物進(jìn)化中保守分子，如脂多糖（LPS）、肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等。TLRs是一個(gè)受體家族，在人中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個(gè)成員，即TLR1-10。TLR4介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳遞涉及幾種通路，但zui終都要激活NF-κB或MAPK作用。zui近報(bào)道，和正常小鼠相比，TLR4缺乏的小鼠周?chē)窠?jīng)損傷后異常性疼痛的程度降低。而反義寡核苷酸阻滯脊髓背角TLR4表達(dá)可以減緩機(jī)械性超敏反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4在周?chē)窠?jīng)損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞活化中也同時(shí)出現(xiàn)。反義寡核苷酸減低脊髓背角TLR4表達(dá)的同時(shí)CR3的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化也受到了抑制因此，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4是周?chē)窠?jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵介質(zhì)，TLR4也為神經(jīng)病理性疼痛的預(yù)防和治療提供了一個(gè)新的方案。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（ELISA）。預(yù)先包被的抗體為多克隆抗體。檢測(cè)相抗體也為多克隆抗體，經(jīng)*（biotin）標(biāo)記。樣品和*標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測(cè)因子呈正相關(guān)。

每套試劑盒中內(nèi)容（96T）
材料 數(shù)量
標(biāo)準(zhǔn)品 96T（2vial）
預(yù)包被抗體的96孔板 96T（8×12）
*標(biāo)記抗體 96T （1:100）
ABC（親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物） 96T （1:100）
樣品稀釋液 96T×2
抗體稀釋液 96T×1
ABC稀釋液 96T×1
TMB顯色液A 96T×1
TMB顯色液B 96T×1
TMB終止液 96T×1
ELISA洗滌液 96T×1（1:25）

需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3． 自動(dòng)洗板機(jī)。
4． 單通道或多通道可調(diào)節(jié)移液器以及其吸頭。
5． 蒸餾水，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管。

注意事項(xiàng)
1． 從-20℃取出的試劑盒，在4℃解凍過(guò)夜。盒內(nèi)每一瓶解凍的溶液在開(kāi)啟瓶蓋之前都要輕輕搖勻，避免解凍時(shí)出現(xiàn)的分層，否則會(huì)出現(xiàn)濃度不均一的現(xiàn)象。
2． 開(kāi)啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
3． 配制各種試劑時(shí)，切記混勻！
4． 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
5． 建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測(cè)。
6． 要嚴(yán)格避免操作過(guò)程中酶標(biāo)板干燥。干燥會(huì)使酶標(biāo)板上生物成份迅速失活！
7． 為免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

樣品的準(zhǔn)備和保存
樣品如果不立即分析，應(yīng)分裝后冷凍保存，且避免反復(fù)凍融。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時(shí)或4℃過(guò)夜，離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細(xì)胞培養(yǎng)、組織勻漿、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻(xiàn)了解標(biāo)本內(nèi)待測(cè)因子的含量，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測(cè)因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測(cè)范圍。樣品的稀釋?xiě)?yīng)有詳細(xì)記錄。

試劑的準(zhǔn)備和保存
A. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和使用：在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。將凍干品管內(nèi)加入1ml樣品稀釋液，*溶解后做倍比稀釋。
稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品在2小時(shí)內(nèi)使用。

B．*標(biāo)記抗體工作液：在使用前2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量（實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul*標(biāo)記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C．親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）工作液的準(zhǔn)備：在使用前1小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備。
1． 根據(jù)每孔需要0.1ml計(jì)算總的用量（實(shí)配時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

D. TMB顯色工作液的準(zhǔn)備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

操作程序
1． 確定本次檢測(cè)所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目。
2． 將倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對(duì)照。處理后的標(biāo)本按100ul每孔加入。
3． 酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)90分鐘。
4． 反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸去酶標(biāo)板內(nèi)的液體；或甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對(duì)著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5． 將準(zhǔn)備好的*抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應(yīng)30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液，37℃避光反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中，要經(jīng)常的觀察，當(dāng)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔差別不明顯時(shí)，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應(yīng)zui長(zhǎng)不要超過(guò)30分鐘）。
10． 用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定O.D.值。
11． 根據(jù)樣品的吸光值在坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的濃度。用戶也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了N倍，其實(shí)際濃度應(yīng)該×N。

操作程序總結(jié)：
準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)90分鐘

洗板2次，加入*化抗體工作液，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應(yīng)

加入TMB終止液

30分鐘之內(nèi)讀OD值

計(jì)算標(biāo)本待測(cè)因子含量

檢測(cè)范圍：10000pg/ml→156pg/ml。
敏感性： ＜15pg/ml
特異性： 系統(tǒng)和其它因子無(wú)交叉反應(yīng)。
保存： -20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]
有效期： 12個(gè)月（-20℃）。
用途： 用于體外定量分析液體標(biāo)本（通用型）。

REFERENCES
1. Nature 388:394-397（1997）.
2. Nat. Genet. 25:187-191（2000）.
3. Protein Sci. 13:2819-2824（2004）.
4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:588-593（1998）.
5. Nature 408:111-115（2000）.
6. J. Biol. Chem. 277:1845-1854（2002）.
7. J. Immunol. 173:3589-3593（2004）.
8. Cell 130:906-917（2007）.
9. Genetics 158:1657-1664（2001）.
10. Hum. Mol. Genet. 14:1449-1455（2005）.