摘  要  本文概括介紹并比較了固定化技術(shù)的幾種主要的方法，并對(duì)目前筆者正在進(jìn)行的包埋法固定化試驗(yàn)中的兩個(gè)方法——海藻酸鈉包埋法和PVA—H₃BO₃包埋法做了一定的介紹和不同方法的比較。zui后，簡(jiǎn)要介紹了固定化細(xì)胞的性能的評(píng)價(jià)以及該種技術(shù)的應(yīng)用和前景。

關(guān)鍵字 固定化 包埋法 海藻酸鈉  PVA—H₃BO₃  載體

1、引言

固定化微生物技術(shù)使用化學(xué)或物理手段，將游離細(xì)胞或者酶定位于限定的區(qū)域，使其保持活性并可反復(fù)利用的方法。zui初主要用于發(fā)酵生產(chǎn)，70年代后期，被利用到水處理領(lǐng)域，近年來則成為各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。固定化微生物技術(shù)克服了生物細(xì)胞太小，與水溶液分離較難，易造成二次污染的缺點(diǎn)，保持了效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、能純化和保持菌種的優(yōu)點(diǎn)，在廢水處理領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。在實(shí)際應(yīng)用過程中，如何固定、何種載體，才能使固定化微生物能較長(zhǎng)時(shí)間的保持一定的強(qiáng)度和活度，才能降低固定化成本，延長(zhǎng)固定微生物的使用壽命，是該技術(shù)在污水處理中得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

2、常用的固定化方法

廢水處理中常用微生物固定化方法主要有：包埋法、交聯(lián)法、載體結(jié)合法。

 2.1包埋法

包埋法的原理是將微生物細(xì)胞截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中。通過聚合作用或者離子網(wǎng)絡(luò)形成，或通過沉淀作用，或改變?nèi)軇?、溫度、pH值使細(xì)胞截流。凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)可以阻止細(xì)胞的泄漏，同時(shí)能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散出來。

固定化微生物細(xì)胞的實(shí)用化對(duì)包埋載體的要求包括：

（1）    固定化過程簡(jiǎn)單，易于制成各種形狀，能在常溫常壓下固定化；

（2）    成本低；

（3）    固定化過程中及固定化后對(duì)微生物無害；

（4）    基質(zhì)通透性好；

（5）    固定化細(xì)胞密度大；

（6）    載體內(nèi)細(xì)胞漏出少，外面的細(xì)胞難以進(jìn)入；

（7）    物理強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性好；

（8）    抗微生物分解；

（9）    沉降分離性好。

 在這些要求中，（1）和（2）涉及固定化細(xì)胞制備的成本；（3）~（6）針對(duì)固定化細(xì)胞的催化活性；而（7）~（9）則是出于對(duì)固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性的考慮。

2.2交聯(lián)法

交聯(lián)法是使用雙功能的試劑與酶分子進(jìn)行分子間的交聯(lián)固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶顯著失活。此外，交聯(lián)劑如戊二醛等價(jià)格昂貴，限制了其應(yīng)用。

2.3吸附法

又稱載體結(jié)合法，是通過物理吸附、化學(xué)或者離子的結(jié)合，將微生物固定于非水溶性載體。這種方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)微生物活力影響小，但所結(jié)合的微生物數(shù)量有限，反應(yīng)穩(wěn)定性和反復(fù)使用性差。主要分為物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法、離子結(jié)合法和生物特異性吸附法四種方法。

2.4三種固定化方法的比較

盡管固定化方法多種多樣，但沒有一種理想的、普遍適用的方法。交聯(lián)法突出優(yōu)點(diǎn)是可以獲得很高的細(xì)胞密度，但由于缺乏良好的機(jī)械強(qiáng)度而不能得到廣泛的應(yīng)用。吸附法的固定操作簡(jiǎn)單，條件溫和，而且載體可以再生；但是細(xì)胞與載體之間的結(jié)合力較弱，因此操作的穩(wěn)定性不好。包埋法有較好的綜合性能，催化活性保留和存活力都比較高，且包埋在反應(yīng)工程（包括反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、操作穩(wěn)定性等）中應(yīng)用靈活，因此，包埋法成為整個(gè)固定化生物催化劑技術(shù)中應(yīng)用zui廣泛的固定化方法；但是包埋法的擴(kuò)散阻力較大，使細(xì)胞的催化活性受到限制，且不適用于涉及大分子物質(zhì)的反應(yīng)。三種固定化方法總結(jié)于下表：

 

表一 三種固定化方法的比較

 

3、包埋法固定化微生物的兩種方法舉例

天然高分子多糖類的海藻酸鈉，具有固定化成形方便，對(duì)微生物毒性小以及固定化密度高等優(yōu)點(diǎn)，但是其抗微生物分解性能較差，機(jī)械強(qiáng)度較低，同時(shí)*再高濃度的磷酸緩沖液的反復(fù)沖擊下，經(jīng)過一段時(shí)間，顆粒變軟、粘連。合成高分子化合物中常用的載體材料是*（polyvinyl alcohol 簡(jiǎn)稱PVA），其突出優(yōu)點(diǎn)是抗微生物分解性能好，機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)穩(wěn)定性能好。但是聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成條件比較劇烈，對(duì)微生物細(xì)胞的損害較大，而且成形的多樣性和可控性不好。下面將對(duì)這兩種包埋方法作一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹：

3.1海藻酸鈣包埋法

3.1.1原理

    海藻酸鈣包埋法是一種使用zui廣、研究zui多的包埋固定化方法，它具有固化、成形方便，對(duì)微生物毒性小，固定化細(xì)胞密度高等優(yōu)點(diǎn)。

海藻酸是用于包埋固定化微生物的*個(gè)聚合物，但是當(dāng)存在高濃度的K⁺、Mg²⁺、磷酸鹽以及其他單價(jià)金屬離子時(shí)，海藻酸鈣凝交的結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞。此外，由于海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸太大，酶可能會(huì)從網(wǎng)絡(luò)中泄露出來，因此不適合大多數(shù)酶的固定化。

海藻酸鹽是棕色藻類的胞內(nèi)產(chǎn)物，它由兩種不同類型的單糖組成，即1，4—β—D—甘露糖醛酸（M）和1，4—α—L—古洛糖醛酸（G）。海藻酸鹽是一種聚合物。

海藻酸鹽不能形成熱可逆性凝膠。通常是在其鈉鹽溶液中加入二價(jià)離子，如Ca²⁺，通過Ca²⁺取代Na⁺來形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。凝膠的性質(zhì)與引入的二價(jià)陽離子及海藻酸鈉的類型（主要是兩種單糖的組成比例）有關(guān)。

二價(jià)陽離子對(duì)凝膠的機(jī)械強(qiáng)度有較大的影響，元素周期表的第二主族金屬離子于海藻酸鈉鹽形成的凝膠，其強(qiáng)度順序如下：

Ba²⁺>Sr²⁺>Ca²⁺>>Mg²⁺

利用*固定化微生物法安全、快速、制備簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，成本低廉且適用于大多數(shù)微生物的固定化。

3.1.2固定化方法

以海藻酸鹽為載體，建立包埋固定化微生物的方法如下：

方法I

①將海藻酸鈉加熱溶于水；

②將海藻酸鈉溶液與微生物細(xì)胞混合均勻，使海藻酸鈉zui終濃度為2%~4%；

③將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入5%~10%的CaCl₂溶液中，固定化7~8h；

④濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

方法 II

①將按方法I制得的固定化細(xì)胞顆粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中攪拌1~2h；

②濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；

③濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

方法III

①將按方法I制備的固定化顆粒浸泡于下列溶液中：

  殼聚糖 0.5%   CaCl₂ 0.2mol/L  pH 6.0

②濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；

③濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。

 分別利用以上三種固定化方法，包埋黑曲酶細(xì)胞，比較各種固定化細(xì)胞的活性，其結(jié)果如表二：

 

                      表二 海藻酸鈣包埋法的比較

 

由表二可以看出，用海藻酸鈉系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化細(xì)胞的活性較高。其中用方法I固定化細(xì)胞的活性zui高，在方法II、III中，由于在海藻酸鈣凝膠表層突上了一層高分子膜，雖然增強(qiáng)了固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度，但是同時(shí)加大了底物及氧的擴(kuò)散阻力，從而降低了細(xì)胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛對(duì)細(xì)胞液具有毒性，在使用前應(yīng)作毒性試驗(yàn)，確定是否采用改種交聯(lián)劑。

3.1.3海藻酸鈉包埋法固定化試劑對(duì)細(xì)胞活性的影響

（1）海藻酸鈉對(duì)細(xì)胞活性的影響

    海藻酸鈉是一類天然高分子多糖類，對(duì)微生物沒有毒害作用。但海藻酸鈉的濃度會(huì)影響固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度、質(zhì)量傳遞等，進(jìn)而影響到微生物的活性。

海藻酸鈉濃度對(duì)固定化細(xì)胞活性的影響如表三所示。

 

表三 海藻酸鈉濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響