產(chǎn)品信息
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 價格 |
wb301102 | 重組PreScission蛋白酶 | 200U | 1029 |
wb301105 | 重組PreScission蛋白酶 | 500U | 2699 |
wb301107 | 重組PreScission蛋白酶 | 2000U | 9762 |
產(chǎn)品簡介
PreScission Protease是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（human rhinovirus (HRV) type 14 3C protease）和GST組成的融合蛋白。該蛋白酶可在低溫下（4°C）特異識別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進行酶切。底物的識別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級結(jié)構(gòu)還依賴于融合蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)。它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達出的帶有酶底物識別多肽序列融合蛋白的GST標簽進行分離。本品由大腸桿菌中重組表達，以無菌液體形式提供。
產(chǎn)品性質(zhì)
中文別名（Chinese Synonym） | 重組Prescission蛋白酶 |
英文別名（English Synonym） | 3C protease，Picornain 3C，PSP |
來源（Source） | 大腸桿菌表達 |
分子量（Molecular Weight） | 約46kDa |
物理外觀（Physical Appearance） | 無菌無色液體 |
儲存緩沖液（Storage Buffer） | 25mM Tris-HCl（pH8.0），150mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，50%（V/V）Glycerin |
10×酶切緩沖液（10×Cleavage Buffer） | 500mM Tris-HCl（pH7.0），1.5M NaCl，10mM EDTA，10mM DTT |
純度（Purity） | 經(jīng)SDS-PAGE及HPLC分析，純度> 95% |
酶活定義（Unit Definition） | 在5℃條件下反應16小時，能夠切割10µg的GST標簽的融合蛋白達90%以上所需的酶量定義為一個活性單位 |
運輸和保存方法
運輸方式：干冰運輸。
保存方式：-80℃長期儲存，有效期2年；小量分裝-20℃保存，有效期6個月；10×Cleavage Buffer置于-20°C保存。避免反復凍融！
注意事項
1）100mM ZnCl2、4mM AEBSF和100μM Chymostatin將抑制PreScission Protease 50%以上酶活性；
2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法
工作液濃度應根據(jù)具體實驗確定，建議進行預實驗摸索zuijia實驗濃度。
1）初始條件摸索a. 按照下表設(shè)置酶切反應體系：
反應物組成 | 體積 |
GST融合蛋白 | 100μg |
Prescission Protease | 2μL（1U/μL） |
10×Cleavage Buffer | 10μL |
ddH2O | 至100μL |
b. 將反應混合物置于4℃反應15-16h；
c. 取20μL樣品進行SDS-PAGE電泳分析，根據(jù)結(jié)果，優(yōu)化反應所需的適酶量，重復步驟；
d. 在實際操作中，建議酶用量1:25-1:100U/μg融合蛋白。
2）柱上酶切GST標簽蛋白（以10mg GST標簽蛋白/mL凝膠為例）
a. 4℃條件下，使用10倍柱體積酶切緩沖液洗滌已結(jié)合GST標簽蛋白的純化柱，并去除殘留緩沖液；
b. 準備PreScission Protease：約每100μg GST標簽蛋白使用2U PreScission Protease (或按照經(jīng)步驟1優(yōu)化后的條件)。對于10mg GST標簽蛋白需使用200U PreScission Protease，用PreScission酶切緩沖液稀釋至與凝膠柱相同的體積，即1mL。
c. 將稀釋好的1mL PreScission Protease泵入純化柱中，4°C保持4-8h（為確保酶切*，可以4°C酶切過夜）。如果蛋白結(jié)合是在離心管中進行的，可將準備好的PreScission Protease直接加入離心管中，4°C在搖床上緩慢搖動4-8小時（為確保酶切*，可以4°C酶切過夜）。
d. 用1倍柱床體積的PreScission Protease酶切緩沖液洗滌，重復三次，分別收集每次的洗滌液。如果酶切反應是在離心管中進行的，1000g離心2分鐘，收集上清，然后加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清，接著再加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清。洗脫組分中含有切除了GST標簽的目的蛋白，而GST標簽和帶有GST標簽的PreScission Protease則仍然結(jié)合在凝膠柱上。
3）柱下酶切GST標簽蛋白（以10mg GST標簽蛋白/mL凝膠為例）
a. 使用脫鹽柱快速除去洗脫組分中的GSH、咪唑等特殊組分，或用PreScission Protease酶切緩沖液進行透析。
b. 按每100μg標簽蛋白加入2U PreScission Protease的比例加入蛋白酶，4°C孵育4-8h或者過夜。
c. 將酶切后的蛋白樣品加入預先用PreScission Protease酶切緩沖液平衡好的GSTSep Glutathione Agarose Resin（Cat#20507ES），室溫結(jié)合20-30分鐘。
d. 500g離心5分鐘，收集上清，其中含有切除了標簽的目的蛋白，PreScission Protease則結(jié)合在凝膠沉淀中。如果目的蛋白是GST標簽蛋白，那么殘留的沒有被酶切的GST標簽蛋白、PreScission Protease和酶切下來的GST標簽則結(jié)合在凝膠沉淀中，切除了標簽的目的蛋白在溶液中。
