Screen Quest cAMP檢測試劑盒*比色ELISA法* 腺苷3'，5'環(huán)一磷酸（cAMP）是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第二信使。檢測cAMP的水平是篩選GPCR激動劑和拮抗劑的方法之一。 Screen Quest 比色ELISA cAMP分析試劑盒基于HRP標記的cAMP與未標記的cAMP之間的競爭。通過未標記的游離cAMP將HRP-cAMP從HRP-cAMP /抗cAMP抗體復合物中置換出來。在不存在cAMP的情況下，HRP-cAMP偶聯(lián)物僅與抗cAMP抗體結(jié)合。然而，測試樣品中未標記的游離cAMP與HRP-cAMP抗體偶聯(lián)物競爭抗cAMP抗體，因此抑制了HRP-cAMP與抗cAMP抗體的結(jié)合。我們的Screen Quest 比色ELISA cAMP分析試劑盒提供了一種靈敏的方法，用于在生化或基于細胞的分析系統(tǒng)中檢測腺苷酸環(huán)化酶的活性。與其他ELISA cAMP分析試劑盒相比，我們的試劑盒省去了繁瑣的乙?；襟E。該試劑盒使用Amplite Green作為比色底物來定量HRP活性。該測定可以使用96孔或384孔微孔板進行。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的Screen Quest cAMP檢測試劑盒*比色ELISA法*。
樣品實驗方案
簡要概述
準備樣品
將75 µL /孔的cAMP標準品或測試樣品添加到抗cAMP的96孔板中
在室溫下孵育5-10分鐘
加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶聯(lián)物
在室溫下孵育3小時
用200 µL /孔的洗滌緩沖液洗滌4次
添加100 µL /孔的Amplite Green
在室溫下孵育1至3個小時
檢測405、650或740 nm處的吸光度增加
溶液配制
儲備溶液配制
1. cAMP儲備溶液（100 µM）：將1 mL測定緩沖液（組分B）添加到cAMP標準品（組分A）的小瓶中。
2. HRP-cAMP共軛原液（50X）：將55 µL（#36370）或550 µL（#36371）的測定緩沖液（組分B）添加到HRP-cAMP偶聯(lián)物（組分C）的小瓶中。 注意：未使用的50X HRP-cAMP共軛原液應分為一次性使用的等分試樣，并在-20℃下保存。
3.洗滌液（1倍）：將1 mL的10X洗滌溶液（組分D）添加到9 mL蒸餾水中。
標準溶液配制
在分析緩沖液（組分B）中對cAMP標準品進行1：10、1：100和1：3的系列稀釋，以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀釋溶液。 存放在冰箱或4°C下。
工作溶液配制
HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液：
在使用前，用測定緩沖液（組分B）以1:50稀釋，使其具有1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意：25 µL 1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液足以用于一個測定點； 準備適當?shù)捏w積，僅供一次性使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。
實驗步驟
1.準備樣品
1.1根據(jù)需要處理細胞：
以下是用Forskolin處理的Hela細胞以96孔板誘導cAMP的示例：吸出細胞生長培養(yǎng)基，在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes緩沖液（HHBS），在5％CO2，37°C恒溫箱，放置15分鐘。孵育后吸出細胞溶液，加入100 µL /孔的細胞裂解緩沖液（組分E），然后在室溫下另外孵育10分鐘。該細胞裂解液可以直接測定，也可以在測定緩沖液（組分B）中稀釋后測定。注意：應單獨評估每個細胞系，以確定細胞密度。細胞可以在實驗的前或?qū)嶒灝斕旖臃N，具體取決于細胞類型和/或受試化合物的作用。
1.2組織樣本：
由于組織中環(huán)狀核苷酸的快速代謝，重要的是在收集后快速冷凍組織（例如，使用液氮）。稱重冷凍的組織，并添加10-20 µL / mg細胞裂解緩沖液。在冰箱均質(zhì)樣品。高速旋轉(zhuǎn)5分鐘并收集上清液。上清液可以直接測定。
1.3尿液，血漿和培養(yǎng)基樣品：
尿液和血漿可以直接在1X裂解緩沖液中以1：200至1：1000的稀釋度進行測試。也可以在裂解緩沖液中以1:10至1：200的稀釋度測試培養(yǎng)基。注意：RPMI介質(zhì)可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP測定
2.1所有測定孔均按以下順序準備：A）cAMP標準品，對照或測試樣品； B）HRP-cAMP偶聯(lián)物。
2.2將75 µL /孔的cAMP稀釋標準溶液和測試樣品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（組分F）的每個孔中。 我們建議對每個標準品和測試樣品重復測定。在室溫下孵育5至10分鐘。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶聯(lián)物工作溶液。 將板放在搖床上，在室溫下孵育3小時。
2.4吸出板內(nèi)容物，并用200 µL /孔的1X洗滌液洗滌4次。
2.5在每個孔中加入100 µL /孔的Amplite Green（組分G），并在避光的情況下在室溫下孵育60分鐘至3小時。
2.6使用光吸收酶標儀檢測在405 nm，650 nm或740 nm處的吸光度增加。
