5min RNA純化試劑盒

描述：RNA 純化試劑盒的優(yōu)點(diǎn)為迅速僅需 5min 即可完成操作，回收率可高達(dá) 70～95％。該試劑盒采用 高特異吸附能力的硅膠吸附柱，應(yīng)用優(yōu)化好的特定緩沖 液，可選擇性地結(jié)合回收目標(biāo) RNA，并去除雜蛋白、鹽 等。該試劑盒每次可純化得到高達(dá) 50 μg 的 RNA 片段 (>15nt)，回收的產(chǎn)物可直接用于 RT-PCR、用于 NGS 的 RNA 文庫(kù)制備、基因編輯、顯微注射、RNA 標(biāo)記、轉(zhuǎn)染 等。

 組分

自備試劑：75%乙醇。
儲(chǔ)存：室溫保存，有效期 2 年。
操作方法
1. 向 50 µl 待回收樣品中加入 100 µl RNA CleanupBinding Buffer 用槍頭吹打混合均勻。
注意：若樣品不足 50 µl 需加入 RNase Free H2O 補(bǔ)至 50 µl；若樣品大于 50 µl 則可按比例縮放緩沖液體積，當(dāng)樣品大于 150 µl 時(shí)應(yīng)上兩根吸附柱。
2. 向上述溶液中加入預(yù)冷 150 µl 無(wú)水乙醇（等體積），槍頭吹打混合均勻。（當(dāng) 15nt<RNA<25nt 時(shí)可加入 2倍體積的無(wú)水乙醇）。
3. 將上述溶液共 300 µl 加入到吸附柱中，室溫靜置 30s。4℃ 13,000rpm 離心 30s，棄去過(guò)柱液。
4. 向吸附柱中加入預(yù)冷的 700 µl 75%乙醇，4℃13,000rpm 30s，棄去過(guò)柱液，重復(fù)此步驟一次。
5. 13,000rpm 空離 2min 后，將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的 1.5ml收集管中，室溫放置 2min 使殘留乙醇揮發(fā)。
6. 向吸附柱芯中加入 50~100 µl RNase Free H2O，室溫靜置 1min 后，4℃ 13,000rpm 離心 2min，獲得的產(chǎn)物即為純化的 RNA?？闪⒓词褂没蛴?80℃保存。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。