2XRAPA HiFi PCR Mix(with dye)

RAPA HiFi DNA 聚合酶，其來源于高保真 DNA 聚合 酶，并加入了增強的延伸結(jié)構(gòu)，使其具有超保真性能（~280 倍 Taq）、長片段擴增能力、高產(chǎn)量。長片段擴增能力，使用 該酶可輕松擴增 8kb 的基因組 DNA、20kb 的λ DNA、8kb 的 cDNA。該酶具有 6kb/min 以上的延伸速度。該 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、強 3’-5’的外切酶活性，產(chǎn)物為平末 端。該制品中已經(jīng)含有溴酚藍染料，PCR 擴增完畢后可直接 點樣于瓊脂糖凝膠，無需再加入 DNA Loading Buffer。

特點和用途
(1) 超保真擴增：~280 倍 Taq 的保真性能，是載體構(gòu)建、點突變、NGS 模板擴增、基因合成的用酶。
(2) 快速擴增：具有 6kb/min 的擴增能力。
(3) 長片段擴增：質(zhì)粒、λDNA 等簡單模板可以有效擴增>20 kb，基因組可以有效擴增>8 kb，cDNA 可以有效擴增>8kb。
儲存：長期儲存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 個月）保存。
使用方法
1. 按下表配制反應(yīng)體系并混合均勻：
2×RAPA HiFi PCR Mix 12.5 μl
上游引物(10 μM) 1 μl
下游引物(10 μM) 1 μl
模板 DNA 1-250 ng
ddH2O up to 25 μl
*模板 DNA 用量參數(shù)(25 μl 反應(yīng)體系)
5-250 ng Genomic DNA
0.1-10 ng Plasmid DNA
1-2 μl cDNA from RT reaction
2. PCR 擴增循環(huán)參數(shù)
（1）擴增片段<5kb 時采用如下程序
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
1st Cycle 95°C 1min
25-35 Cycles
95°C 30s
50~60°C 30s
72°C 6kb/min
Last Cycle 72°C 2min
（2）擴增片段>5kb 時采用如下程序
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
1st Cycle 92°C 1min
25-35 Cycles
92°C 30s
50~60°C 30s
72°C 2-3kb/min
Last Cycle 72°C 2min
3. 電泳：1% 瓊脂糖凝膠電泳，上樣 5 μl，電泳結(jié)束在紫外燈下檢測條帶。
4. 注意事項：（1）當(dāng)模板 GC 含量>65%時，請?zhí)砑?br style="box-sizing: border-box; margin: 0px;"/>5× Q-Solution（Cat. No.: A3002）。（2）當(dāng)擴增片段<1kb>5kb 時，按照2-3kb/min 的延伸時間進行設(shè)置，能獲得更高的產(chǎn)量。（3）由于不同的 PCR 管其導(dǎo)熱性能有所不同，通常 PCR 采用25μl 體系可以獲得更高的產(chǎn)量。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。