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Amplite 比色法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于β-半乳糖苷酶的試劑盒，大腸桿菌β-半乳糖苷酶是464kD四聚體。每個(gè)單位的β-半乳糖苷酶由五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中第三個(gè)是活性位點(diǎn)。它是細(xì)胞中的酶。這種酶的缺乏可導(dǎo)致半乳糖醛酸病或Morquio B綜合征。在大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶是由LacZ操縱子的活化產(chǎn)生的。 LacZ表達(dá)的檢測已經(jīng)成為每個(gè)細(xì)胞檢測少至5個(gè)拷貝的β-半乳糖苷酶的常規(guī)方法。該試劑盒使用發(fā)色半乳糖苷酶底物，可以靈敏地區(qū)分LacZ +和LacZ-細(xì)胞。淡黃色底物在與半乳糖苷酶反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)紫色產(chǎn)物。它可用于檢測ELISA型測定系統(tǒng)中的半乳糖苷酶綴合物或用于監(jiān)測細(xì)胞中LacZ基因的表達(dá)。 Amplite 比色β-半乳糖苷酶檢測試劑盒配備了所有必需成分和優(yōu)化的檢測方案。它可用于篩選半乳糖苷酶抑制劑或誘導(dǎo)劑。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的Amplite 比色法β-半乳糖苷酶檢測試劑盒。

適用儀器

光吸收酶標(biāo)儀
吸收:	580/460nm
推薦孔板:	透明孔板

實(shí)驗(yàn)方案

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1.用LacZ基因制備穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞
2.用測試化合物孵育細(xì)胞（樣品）
3.裂解細(xì)胞
4.將裂解液轉(zhuǎn)移至微量滴定板
5.添加β-Gal工作液
6.根據(jù)細(xì)胞類型，在室溫或37°C孵育至少10分鐘
7.添加停止反應(yīng)試劑
8.監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm的熒光強(qiáng)度

溶液制備

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1 β-半乳糖苷酶底物儲備液（200X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到試鹵靈β-半乳糖苷酶（組分A）的小瓶中，制成200Xβ-半乳糖苷酶底物原液。注意：25 µLβ-半乳糖苷酶底物儲備液足以容納1個(gè)板，避光。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液

β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品
可選（如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線）：用0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液制備一系列β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液。將標(biāo)準(zhǔn)曲線上每個(gè)點(diǎn)的等分試樣50 µL轉(zhuǎn)移至平板的對照孔中。 β-半乳糖苷酶的高推薦量為200 mU / mL（200-400 ng）。建議按1：3的比例稀釋由8個(gè)點(diǎn)組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線以適合特定的實(shí)驗(yàn)條件，例如細(xì)胞類型，數(shù)量，轉(zhuǎn)染效率和培養(yǎng)板的大小。每次進(jìn)行測定時(shí)，必須新鮮制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋液。

3.工作溶液

1.1 0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液：
將30 µLβ-巰基乙醇（組分F）添加到10 mL反應(yīng)緩沖液（組分B）中，并充分混合。注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2 β-Gal工作液：
將25 µLβ-半乳糖苷酶底物儲備液（200X）加入5 mL的0.3％β-巰基乙醇測定緩沖液中。注意：β-Gal工作溶液足以用于一塊96孔板。

1.3 裂解緩沖液工作液：
使用前，將5 µLβ-巰基乙醇（組分F）加入5 mL裂解緩沖液（組分D）中。注意：在裂解細(xì)胞之前，將0.1％β-巰基乙醇添加到裂解緩沖液中。

樣品操作及分析

表1.細(xì)胞培養(yǎng)板推薦的Lysis Buffer工作溶液體積

培養(yǎng)板類型	裂解緩沖液工作溶液（µL /孔）
96孔板	50
24孔板	250
12孔板	500
6孔板	1000
60毫米板	2000
100毫米板	4000

1.從哺乳動物細(xì)胞制備細(xì)胞提取物

1.1用測試化合物處理含有LacZ基因的細(xì)胞所需的時(shí)間。

1.2用1X PBS洗滌細(xì)胞兩次。不要移動細(xì)胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相應(yīng)地裂解細(xì)胞。

1.3.1對于貼壁細(xì)胞：將Lysis Buffer工作溶液添加至培養(yǎng)板。有關(guān)建議的數(shù)量，請參見表1。

1.3.2對于非貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞沉淀到離心管中，并向管中加入50-2000 µL Lysis Buffer工作溶液（取決于細(xì)胞沉淀的大小）。

1.4將上一步的細(xì)胞在室溫下孵育10-15分鐘，然后輕輕旋轉(zhuǎn)平板或試管數(shù)次以確保裂解。

1.5繼續(xù)進(jìn)行β-半乳糖苷酶測定，或?qū)悠吩?80°C下冷凍直至使用。注意：通過快速的凍融循環(huán)（在-20°C到-80°C冷凍1-2小時(shí)，然后在室溫解凍）也可以獲得良好的裂解。或者，將細(xì)胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶物，然后測定上清液。

2.運(yùn)行?-半乳糖苷酶測定

2.1如果需要，在室溫下解凍裂解細(xì)胞管或板。如果細(xì)胞接種在96孔板上，則直接在96孔板上進(jìn)行測定。

2.2在96孔板的每個(gè)孔中加入50 µL細(xì)胞提取物。如果需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，請為標(biāo)準(zhǔn)曲線保存一些對照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率很高時(shí)，可在裂解緩沖液工作溶液中稀釋裂解液，或在轉(zhuǎn)染效率低時(shí)減少裂解液的體積。如果在96孔板上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，或?qū)⒎€(wěn)定的細(xì)胞系接種到96孔板上，請直接在板上進(jìn)行測定。對于內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性控制，請?zhí)砑?0 µL非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞裂解液。對于空白對照，添加50 µL Lysis Buffer工作溶液。

2.3向每個(gè)孔中加入50 µL的ResorufinβDG工作溶液。根據(jù)細(xì)胞類型，將板在室溫或37°C下孵育大約10分鐘至4小時(shí)。

2.4向每個(gè)孔中添加50 µL終止緩沖液（組分C）。

2.5使用吸光度酶標(biāo)儀測量在580 nm至460 nm（Ab580 / Ab460）波長下的OD比，監(jiān)測吸光度的增加。