MycoLight 比率細菌膜電位試劑盒是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測細菌的試劑盒，AAT Bioquest試劑盒使用熒光傳感器，在低濃度的革蘭氏陽性和陰性細菌細胞中均呈現(xiàn)綠色熒光，但由于較大的染料分子聚集，熒光在較高的細胞溶質(zhì)濃度下向紅色發(fā)射轉(zhuǎn)移膜電位。 膜電位的大小隨著不同的細菌種類而變化。 對于許多革蘭氏陽性物種，紅/綠比率傾向于隨質(zhì)子梯度的強度而變化，而在許多革蘭氏陰性細菌中，染料的響應(yīng)似乎與質(zhì)子梯度強度不成比例。 該試劑盒設(shè)計用于在細菌濃度范圍為每毫升105-107個生物體時測定細菌膜電位。 可以在510-530nm（FITC濾波片組）和600-660nm（德克薩斯紅色濾波片組）下熒光測量染色細胞，激發(fā)波長為常見的激發(fā)光源488nm。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的MycoLight 比率細菌膜電位試劑盒。

操作方法

1.在任何適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)細菌從對數(shù)期培養(yǎng)物中獲得健康細菌的結(jié)果。在PBS（組分C）或等效的無菌緩沖液中將細菌培養(yǎng)物稀釋至~106個細胞/ mL?？梢灾苯訌呐囵B(yǎng)基中稀釋細菌而不洗滌。準備足夠的懸浮液，每次測試提供500 mL。

2.將500μl細菌懸浮液等分到流式細胞儀管中，進行每個染色實驗。準備兩個額外的管用于去極化控制和未染色的對照。

3.向去極化的對照樣品中加入10μl500μMCCCP（組分B）并混合。

4.向每個流式細胞儀管中加入5μlMycoStainIt Green（100X）（組分A）并混合（不要在未染色的對照樣品上加入染色劑）。在室溫下孵育樣品30分鐘?？稍?分鐘后分析染色樣品，但信號強度繼續(xù)增加直至約30分鐘。

5.可以在配備有發(fā)射488nm的激光的流式細胞儀中測定染色細菌。在綠色（熒光素濾光片）和紅色（德克薩斯紅色濾光片）通道中收集熒光。應(yīng)使用對數(shù)信號放大收集前向散射，側(cè)向散射和熒光。

6.儀器調(diào)整對于檢測細菌等相對較小的顆粒尤其重要。使用未染色的對照樣品定位前向和側(cè)向散射通道中的細菌群。使用側(cè)向散射作為設(shè)置采集觸發(fā)器的參數(shù)。

7.如上所述，在調(diào)節(jié)流式細胞儀后應(yīng)用去極化的對照樣品。使用正向散射和側(cè)向散射對細菌進行門控并調(diào)整熒光光電倍增管電壓，使得綠色和紅色MFI值近似相等。不要設(shè)置補償。

8.雖然紅色和綠色熒光強度的相對量將隨著細胞大小和聚集而變化，但紅色與綠色熒光強度的比率可以用作膜電位的尺寸無關(guān)指示。還可以通過使用正向散射與側(cè)向散射對細菌進行門控來處理數(shù)據(jù)，并使用紅色與綠色熒光的點圖分析門控群體，將MFI值報告為線性值，而不是通道。

9.在比率直方圖上，在感興趣的峰周圍設(shè)置標記并記錄平均比值。對于紅色與綠色熒光的點圖，設(shè)置感興趣群體周圍的區(qū)域并記錄每個的紅色和綠色平均熒光強度（MFI）值。為了評估數(shù)據(jù)，將紅色種群MFI除以綠色種群MFI。

10.在流式細胞儀中，細菌僅根據(jù)其大小和染色能力進行鑒定。通過熒光顯微鏡檢查每個樣品，以確認檢測到的顆粒確實是細菌。

數(shù)據(jù)分析

圖1.將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期并在PBS中稀釋至1×10 6個細胞/ mL的濃度。 然后將細胞用5μMCCCP處理20分鐘，并與1X MycoStainIt Green孵育30分鐘，然后進行流式細胞術(shù)分析。